Declarație de etică

Toate liniile iPSC au fost derivate anterior din fibroblaste de biopsie cutanată, în urma unui consimțământ informat semnat, colectat în baza aprobării etice acordate de Comitetul de etică a cercetării din South Wales (WA/12/0186) și de South Central Berkshire Research Ethics Committee (REC10/H0505/71) în instalația de celule stem James Martin, Universitatea din Oxford, în conformitate cu protocoale standardizate. Liniile iPSC au fost toate publicate anterior (a se vedea mai jos și tabelul suplimentar 1).

cultura iPSC

Trei linii iPSC derivate de la trei pacienți diferiți cu SLA care poartă un HRE C9orf72 și ca controale, o linie izogenă, generată anterior prin editarea genomului CRISPR/Cas9 folosind repararea direcționată prin omologie¹⁸, și patru linii de control sănătos iPSC potrivite pentru sex și vârstă, au fost utilizate în acest studiu. Toate liniile iPSC au fost publicate anterior și caracterizate pe larg (pentru detalii despre demografie și caracterizare, consultați tabelul suplimentar 1). iPSC au fost cultivate în mTeSR™1 (85850, StemCell Technologies) pe Geltrex™ (A1413302, ThermoFisher) cu schimbări zilnice de mediu. Celulele au fost trecute folosind EDTA (0.5 mM), expandate pentru a produce stocuri consistente de celule congelate pentru studiu (crioconservate în 50% mTeSR™1, 30% ser bovin fetal cu celule stem embrionare (16141002, Merck), 10% KnockOut™ DMEM ( 10829018, ThermoFisher), 10% DMSO (D2650, Merck)) cu maximum 3 treceri ulterioare în timpul experimentării și a fost testat negativ pentru micoplasmă folosind MycoAlert^TM Kit de detectare a micoplasmei (Lonza).

Diferențierea neuronilor motori derivați de iPSC

iPSC au fost diferențiate de MN folosind un protocol publicat anterior³⁹. Pe scurt, inducția neuronală a fost efectuată folosind DMEM-F12/Neurobasal 50:50 suplimentat cu N2 (1X), B27 (1X), 2-Mercaptoetanol (1X), Antibiotic-Antimicotic (1X, toate ThermoFisher), Acid ascorbic (0.5 μM) , Compus C (1 μM, ambele Merck) și Chir99021 (3 μM, sisteme de cercetare și dezvoltare). După două zile de cultură, s-au adăugat acid retinoic (1 μM, Merck) și agonist netezit (500 nM, sisteme de cercetare și dezvoltare). După încă 2 zile, Compusul C şi Chir99021 au fost îndepărtaţi. În ziua in vitro (DIV)18, celulele au fost replacate pe polietilenimină (PEI, 0.07%, Merck) și Geltrex™ (ThermoFisher) sau PDL (Sigma-Aldrich)/Laminin (R&D Systems)/Fibronectin (Corning) în mediu suplimentat suplimentar cu BDNF (10 ng/mL), GDNF (10 ng/mL), Laminin (0.5 μg/mL, toate ThermoFisher) și DAPT (10 μM, sisteme de cercetare și dezvoltare). Trei zile mai târziu, mediul a fost schimbat în mediu microglia așa cum este descris mai jos, iar MN-urile au fost fie co-cultivate cu microglia, fie menținute în monocultură. Jumătate de schimbări medii au fost efectuate la fiecare 2-4 zile.

Diferențierea precursorilor microgliei derivați de iPSC

iPSC au fost diferențiate de precursori de macrofage/microglie așa cum s-a descris anterior^15,40. Pe scurt, formarea corpului embrionar (EB) a fost indusă prin însămânțarea iPSC în godeuri Aggrewell 800 (STEMCELL Technologies) în mTeSR™1 suplimentat cu BMP4 (50 ng/mL), VEGF (50 ng/mL, ambele Peprotech) și SCF (20). ng/mL, Miltenyi Biotec). După patru până la șapte zile cu modificări zilnice de ¾ medii, EB au fost transferate în baloane T175 și diferențiate în X-VIVO15 (Lonza), suplimentat cu Interleukin-3 (25 ng/mL, R&D Systems), MCS-F (100 ng/mL). ), GlutaMAX (1X, ambele ThermoFisher) și 2-Mercaptoetanol (1X). Mediu proaspăt a fost adăugat săptămânal. După aproximativ două luni, precursorii au fost recoltați prin colectarea supernatantului, trecuți printr-o sită celulară (40 μM, Falcon/Greiner) și fie diferențiați la microglia în monocultură, fie cocultură, așa cum este descris mai jos.

Diferențierea microgliei derivate din iPSC

Precursorii microgliei au fost placați pe PEI (0.07%) și Geltrex™ sau PDL/Laminin/Fibronectin folosind mediul nostru de microglia caracterizat anterior¹⁷ compus din Advanced DMEM-F12 (ThermoFisher), GlutaMAX (1X), N2 (1X), Antibiotic-Antimicotic (1X), 2-Mercaptoetanol (1X), Interleukin-34 (100 ng/mL, Peprotech/BioLegend), BDNF ( 10 ng/mL), GDNF (10 ng/mL) și Laminin (0.5 μg/mL). Microglia au fost diferențiate timp de aproximativ 14 zile, cu modificări de jumătate de mediu la fiecare 2-4 zile și colectate pentru extracția ARN/proteinei sau utilizate pentru teste.

Co-cultura de neuroni motori și microglia derivați de iPSC

Co-culturile au fost generate așa cum s-a descris înainte de a utiliza linia HC-2b (Tabel suplimentar 1) pentru a genera MN-uri¹⁷. Pe scurt, la trei zile după replacarea finală a MN-urilor diferențiate (DIV21), au fost recoltați precursori de microglia. MN-urile au fost clătite cu PBS, iar precursorii microgliei resuspendați în mediu microglia au fost adăugați în fiecare godeu într-un raport de 1:1 cu MN-urile. Co-culturile au fost menținute timp de cel puțin 14 zile, cu modificări de jumătate de mediu la fiecare 2-4 zile. În experimente selectate, contactul direct al celor două tipuri de celule a fost prevenit prin placarea microgliei în inserții de cultură de țesut (0.4 µm dimensiunea porilor, 83.3932.040, Sarstedt).

Amorsarea microgliei cu tratament cu LPS și inhibitor MMP9

Pentru monoculturile microgliale, tot mediul a fost aspirat și s-a adăugat LPS (100 ng/mL, L4391, Merck) în mediu microglia timp de 48 de ore. Godeurile de control au primit numai mediu microglia proaspăt. În condiții selectate, tratamente LPS repetitive au fost efectuate în ziua 0, 2 și 4. Pentru co-culturi, tratamentele LPS au fost începute pe DIV25 și efectuate timp de 10 zile. Jumătate din mediu a fost aspirată și înlocuită cu LPS în mediu microglia (concentrație finală: 100 ng/mL), cu modificări suplimentare de jumătate de mediu cu mediu microglia care conține LPS pe DIV29 și 33. În experimente suplimentare, tratamentele cu LPS au fost începute pe DIV25 și efectuat timp de 20 de zile, cu jumătate de modificări media la două zile. BDNF și GDNF au fost îndepărtate din mediile de cultură pentru aceste experimente. Pentru a inhiba MMP9, culturile au fost tratate concomitent cu LPS (100 ng/mL) și inhibitor MMP9 I (MMP9i, 3 μM, 444278, Merck) sau DMSO în concentrații egale (0.3%) ca vehicul de control.

Amorsarea microgliei cu TNF/IL1B

Tot mediul a fost aspirat din monoculturi microgliale și s-au adăugat TNF (50 ng/mL) și IL1B (20 ng/mL, ambele Peprotech) în mediu microglia timp de 48 de ore. Godeurile de control au primit numai mediu microglia proaspăt.

Tratamentul MN-urilor cu inhibitor rhMMP9 și MMP9

MN-urile au fost tratate cu MMP9 uman activ recombinant (rhMMP9, 30 ng/mL, PF024-5UG, Merck) și MMP9i (3 μM, 444278, Merck) sau DMSO în concentrații egale (0.3%) ca vehicul de control. Tratamentele au fost efectuate pe DIV21 și DIV25, iar viabilitatea MN a fost determinată prin testul MTS pe DIV29.

Imagistica live a fagocitozei și cuantificarea

Monoculturile microgliale nestimulate și amorsate cu LPS (100 ng/mL timp de 48 de ore) au fost colorate cu Hoechst în soluție de imagistică cu celule vii (1:10,000, ThermoFisher) timp de 10 minute. pHrodo™ Red Zymosan Bioparticles™ (P35364, ThermoFisher) în soluție de imagistică cu celule vii (50 µg/mL) au fost adăugate la fiecare godeu și imaginile au fost obținute după 150 de minute folosind un sistem de imagistică celulară EVOS™ XL (ThermoFisher) echipat cu un 10x obiectiv. În condiții selectate, celulele au fost tratate suplimentar cu inhibitori de fagocitoză/degradare Citochalasin D (10 μM, C2618, Merck), Bafilomycin A1 (1 μM, 1334, R&D Systems) sau DMSO (vehicul), cu un pretratament de 1 h. Cuantificarea a fost efectuată automat utilizând o macro de analiză în Fiji și aria de particule de fagocitoză per celulă a fost obținută prin împărțirea zonei particulelor de fagocitoză internalizate la numărul de microglie Hoechst-pozitive.

Electrofiziologie patch-clamp

Electrofiziologia cu clemă de plasture cu celule întregi a fost efectuată așa cum a fost descris anterior¹⁷. MN de control sănătos pe DIV 42–46 în cocultură cu control sănătos sau microglia derivată de la pacient C9orf72-ALS au fost menținute într-o soluție extracelulară care conține 167 mM NaCl, 2.4 mM KCl, 1 mM MgCl₂, glucoză 10 mM, HEPES 10 mM și CaCl 2 mM₂ ajustat la un pH de 7.4 și 300 mOsm. Electrozii cu rezistențe la vârf între 7 și 12 MΩ au fost produși din sticlă borosilicată (0.86 mm diametru interior; 1.5 mm diametru exterior). La electrod s-a adăugat o soluție intracelulară care conține 140 mM K-Gluconat, 6 mM NaCI, 1 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM MgATP, 0.5 mM Na₃GTP, ajustat la pH 7.3 și 290 mOsm. Achiziția datelor a fost efectuată folosind un amplificator Multiclamp 700B, digidata 1550 A și software-ul clampEx 6. Rezistență în serie (R_s) a fost menținută la <30 MΩ. Curenții canalului cu funcție de tensiune au fost măsurați pe o clemă de tensiune, unde neuronii au fost pre-pulsați timp de 250 ms cu impuls de -140 mV și a fost aplicată o tensiune în trepte de 10 mV de la -70 mV la +70 mV. Potențialele de acțiune induse (AP) au fost înregistrate pe clema de curent, neuronii au fost ținuți la -70 mV și s-au aplicat 15 trepte de curent de 10 pA de la -10 pA la 130 pA. Curenții de canal cu funcție de tensiune și proprietățile potențialelor de acțiune induse (reobază, AP max, AP peste reobază) au fost cuantificate folosind Clampfit 10.3 (suita pCLAMP Software, Molecular Devices). AP-urile maxime au fost cuantificate prin determinarea numărului de AP-uri în curs cu cel mai lung tren. Durata și amplitudinea AP au fost cuantificate în Matlab R2022a (MathWorks) folosind primul potențial de acțiune înregistrat de la fiecare neuron.

Înregistrări MEA

În total, s-au obținut înregistrări de 2-15 minute ale activității neuronale pentru coculturi în plăci cu 48 de godeuri cu matrice multi-electrode (MEA) (M768-tMEA-48B, Axion BioSystems) folosind sistemul Maestro (Axion Biosystems). Analiza a fost efectuată folosind software-ul AXIS v2.5.2 (Axion BioSystems) cu SD > 5.5 ca prag de detectare. Viteza medie de ardere per godeu a fost calculată prin media tuturor electrozilor activi (> 1 vârf/min) per godeu.

Izolarea ARN și RT-qPCR

ARN-ul a fost extras folosind un kit RNAeasy Mini Plus (Qiagen) și cantități egale de ARN (100 ng) au fost transcrise invers la ADNc utilizând kitul de transcripție inversă de mare capacitate cADN (ThermoFisher). PCR cantitativă în timp real a fost efectuată cu Fast SYBR™ Green Master Mix (ThermoFisher) folosind un sistem PCR LightCycler® 480 (Roche) și primerii (ThermoFisher) enumerați în tabelul suplimentar. 3. Toate kiturile au fost folosite conform instrucțiunilor producătorului. Cuantificarea expresiei genei de pliere relativă a fost efectuată folosind 2^–∆∆Ct metoda cu normalizare la TBP gena de referinta (TBP intervalul Ct 0.5) și expresia genică medie a microgliei de control pentru fiecare experiment.

secvențierea ARN

Trei linii de control sănătos și trei linii iPSC derivate de la pacient C9orf72-ALS au fost diferențiate în microglia, cu trei diferențieri independente pe linie. ARN-ul a fost extras așa cum este descris mai sus. Toate probele de ARN au afișat valori RIN de cel puțin 8.5. Pregătirea probelor și analiza bioinformatică a fost apoi efectuată așa cum a fost descris anterior¹⁷. Pe scurt, probele au fost normalizate la 100 ng înainte de pregătirea bibliotecii. Îmbogățirea transcriptului poliadenilat și pregătirea bibliotecii specifice catenei au fost finalizate utilizând kitul ARNm NEBNext Ultra II (NEB) urmând instrucțiunile producătorului. Secvențierea finală pereche (lungimea de citire: 150 de perechi de baze) a fost efectuată folosind o platformă NovaSeq6000 (Illumina, kit de reactiv NovaSeq 6000 S2/S4, v1.5, 300 de cicluri), generând un număr de citire brută de minim 30 M de citiri per probă . Citirile la capătul pereche au fost mapate la genomul de referință uman GRCH38.p13 (https://www.gencodegenes.org) folosind HISAT2 v2.2.1⁴¹. Tabelul de numărări a fost obținut folosind FeatureCounts v2.0.1⁴². Normalizarea numărătorilor și analiza expresiei diferențiale a fost efectuată folosind DESeq2 v1.28.1⁴³ în RStudio 1.4.1103, incluzând sexul biologic în model și cu metoda Benjamini-Hochberg pentru corectarea testelor multiple. Cele trei diferențieri diferite per condiție au fost prăbușite într-un singur punct de date, dacă nu se indică altfel, unde sexul biologic și replica de diferențiere au fost incluse în model. Analiza exploratorie a datelor a fost efectuată în urma transformării de stabilizare a varianței a tabelului de numărare, folosind analiza componentelor principale. Buturuga₂ schimbarea pliului (log₂ fc) contracția a fost efectuată folosind abordarea „normală”. Gene cu | Buturuga₂ fc| > 0.5 și ajustat p-valoare < 0.05 au fost definite ca gene exprimate diferențial (DEG). Datele au fost interpretate cu adnotări din baza de date Gene Ontology folosind clusterProfiler v3.16.1⁴⁴. Am analizat îmbogățirea căilor prin efectuarea unei analize de suprareprezentare (ORA) pentru toate DEG și analize de îmbogățire a setului de gene (GSEA) pe întregul transcriptom clasat după log₂fc, folosind setările standard din clusterProfiler pentru ORA și GSEA (ajustat p-valoare < 0.05 folosind metoda Benjamini-Hochberg).

Imunofluorescența

Celulele cultivate pe lame de acoperire au fost pre-fixate cu 2% paraformaldehidă (PFA) în PBS timp de 2 minute la temperatura camerei (RT) și apoi fixate cu 4% PFA în PBS pentru încă 15 minute la RT. După permeabilizare și blocare cu 5% ser de măgar și 0.2% Triton X-100 în PBS timp de 1 oră la temperatura camerei, lamelele au fost incubate cu anticorpii primari enumerați în tabelul suplimentar. 2, diluat în 1% ser de măgar și 0.1% Triton X-100 în PBS, la 4 °C ON. După trei spălări cu PBS-0.1% Triton X-100 timp de 5 minute fiecare, lamelele au fost incubate cu anticorpi secundari fluorescenți corespunzători Alexa Fluor® 488/568/647 măgar anti-șoarece/iepure/capră/copiș (toate 1:1000, ThermoFisher). sau Abcam). Lamelele au fost apoi spălate de două ori cu PBS-0.1% Triton X-100 timp de 5 minute fiecare și incubate cu DAPI (1 pg/mL, Sigma-Aldrich) în PBS timp de 10 minute. După o etapă suplimentară de spălare de 5 minute cu PBS-0.1% Triton X-100, lamelele au fost montate pe lamele de microscopie folosind ProLong™ Diamond, Gold sau Glass Antifade Mountant (ThermoFisher). Microscopia confocală a fost efectuată folosind un microscop LSM 710, LSM 880 (ambele Zeiss) sau Fluoview FV1000 (Olympus).

Analiza ramificațiilor microgliale

Patru până la cinci imagini z-stack (interval z: 1 μm) de câmpuri vizuale selectate aleatoriu au fost luate la o mărire de 60x pentru fiecare lamelă și au fost generate proiecții de intensitate maximă în Fiji. Pentru a analiza ramificarea microgliei IBA1 pozitive în monocultură și co-cultură, volumul celulei, indicele de ramificare, lungimea medie a ramurilor și numărul de puncte de ramificare au fost determinate automat folosind 3DMorph așa cum este descris în altă parte.¹⁹.

Cuantificarea localizării greșite a TDP-43 în microglia

Patru până la cinci imagini z-stack ale câmpurilor vizuale selectate aleatoriu au fost luate la o mărire de 60x pentru fiecare lamelă și au fost generate proiecții de intensitate maximă în Fiji. Valorile medii de intensitate pentru TDP-43 în nucleu și citoplasmă au fost determinate într-un mod orb, cu semnalul DAPI și IBA1 utilizat pentru a identifica granițele nucleare și, respectiv, citoplasmatice. Raportul dintre TDP-43 citoplasmatic și nuclear a fost apoi calculat.

Cuantificarea expresiei markerului microgliei în monoculturi de microglie

Trei imagini z-stack ale câmpurilor vizuale selectate aleatoriu au fost luate la o mărire de 40x pentru fiecare lamelă și au fost generate proiecții de intensitate maximă în Fiji. Numărul de nuclee DAPI-pozitive și IBA1⁺/DAPI⁺ și TMEM119⁺/DAPI⁺ celulele au fost cuantificate automat pe câmp de vizualizare pentru fiecare linie folosind o macrocomandă.

Cuantificarea numerelor și raporturilor microglielor și neuronilor motori în co-cultură

Trei până la cinci imagini z-stack ale câmpurilor vizuale selectate aleatoriu au fost luate la o mărire de 10x sau 40x pentru fiecare lamelă și au fost generate proiecții de intensitate maximă în Fiji. Pentru microglia, folosind o macro, a fost aplicat un prag automat pe canalul IBA1 pentru a crea o mască, iar numărul de celule microgliale a fost determinat pentru fiecare câmp de vizualizare prin numărarea numărului de nuclei DAPI-pozitivi din cadrul măștii IBA1 utilizând "analizarea". funcția particulelor. Pentru MN, a fost aplicat un prag automat pe canalul TUJ1 pentru a crea o mască, iar numărul de neuroni a fost determinat pentru fiecare câmp de vizualizare prin numărarea numărului de nuclee pozitive DAPI din masca TUJ1 folosind funcția „analiza particule”. Pentru a calcula raportul microglia:MN, numărul de celule microgliale a fost împărțit la numărul MN. Pentru evaluarea supraviețuirii MN după expunerea pe termen lung la LPS, numărul absolut MN a fost normalizat la media liniilor de control pentru a determina supraviețuirea relativă a MN prin luarea în considerare a efectelor lotului între diferențieri după cultura pe termen lung.

Cuantificarea expresiei markerului apoptotic în co-cultură

Cinci imagini z-stacks ale câmpurilor vizuale selectate aleatoriu au fost luate la o mărire de 40x pentru fiecare lamelă. Au fost generate proiecții de intensitate maximă. Folosind o macrocomandă, a fost aplicat un prag automat pe canalul TUJ1 pentru a crea o mască, iar expresia markerului apoptotic CC3 în neuroni a fost determinată pentru fiecare câmp de vizualizare prin cuantificarea zonei semnalului CC3 din masca TUJ1 utilizând "analiza". funcția particulelor. Pentru a ține seama de efectele de lot între diferențieri, modificarea pliului în expresie a fost generată prin normalizarea măsurătorilor absolute la media liniilor de control.

Cuantificarea creșterii neuriților în co-cultură

Patru până la cinci stive-z de câmpuri de vizualizare selectate aleatoriu care prezintă neuriți, dar evitând soamele neuronale au fost obținute la o mărire de 60x pentru fiecare lamelă. Proiecțiile de intensitate maximă au fost generate în Fiji. Folosind o macro, s-a aplicat un prag automat colorării TUJ1, iar creșterea neuritei pentru fiecare câmp de vizualizare a fost determinată prin măsurarea ariei de neuriți pozitivi TUJ1 pe câmp de vizualizare folosind funcția „analiza particulelor” în Fiji.

Analiza expresiei sinaptofizinei neuronale

Patru până la cinci imagini z-stacks ale câmpurilor vizuale selectate aleatoriu au fost luate la o mărire de 60x pentru fiecare lamelă. Proiecțiile de intensitate maximă au fost generate în Fiji. Folosind o macro, un prag automat a fost aplicat colorării sinaptofizinei pentru a analiza structurile sub formă de puncte, iar numărul și aria particulelor de sinaptofizină au fost determinate pentru fiecare câmp de vizualizare folosind funcția „analiza particule” în Fiji.

RNAscope

Focarele de ARN au fost detectate utilizând testul RNAscope Multiplex Fluorescent v2 (323100, ACD) conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, microglia iPSC fixată cu 4% PFA a fost deshidratată succesiv cu 50%, 70% și 100% etanol timp de 1 minut fiecare și depozitată la -20 ° C. După rehidratare cu 100%, 70% și 50% etanol, celulele au fost incubate cu 0.1% Tween-20 în PBS, peroxid de hidrogen și Protează III (raport de diluție 1:15) timp de 10 minute fiecare, cu spălări cu PBS între ele. Sonde care vizează (G₄C₂)_n și (C₄G₂)_n expansiunile (ACD, 884351-C2 și 884361-C2) au fost adăugate la lamele separate și incubate timp de 2 ore, urmate de pași de amplificare și dezvoltare conform protocolului standard. ICC secvenţial a fost realizat prin incubare cu anticorp primar împotriva IBA1 (1:200, 019-19741, Wako Fujifilm) timp de 2 ore la temperatura camerei şi apoi conform protocolului de imunofluorescenţă detaliat mai sus.

Cuantificarea formării focarelor de ARN în microglia

Cinci imagini z-stack ale câmpurilor vizuale selectate aleatoriu au fost luate la o mărire de 40x sau 63x pentru fiecare lamelă și au fost generate proiecții de intensitate maximă în Fiji. Numărul de celule focare pozitive și numărul de focare per nucleu focar pozitiv au fost determinate prin numărare manuală.

Testul de viabilitate MTS

În experimente selectate, viabilitatea MN a fost determinată utilizând testul de proliferare celulară CellTiter 96® AQueous One Solution (MTS, G3580, Promega) conform instrucțiunilor producătorului. Citirile pe plăci au fost efectuate după 90-120 de minute de incubare cu reactivi de analiză.

Măsurarea eliberării de citokine/chemokine și neurofilament

Supernatanții de cultură au fost colectați și centrifugați la 1200 xg și 4 °C timp de 10 minute. Probele grupate au fost analizate folosind Proteome Profiler Human XL Cytokine Array (ARY022B) sau Protease/Protease Inhibitor Array (ARY025, ambele sisteme de cercetare și dezvoltare) conform instrucțiunilor producătorului. Semnalul a fost vizualizat pe un ChemiDoc^TM Sistem de imagistică MP (Bio-Rad) și analizat folosind ImageStudioLite v5.2.5 (LI-COR). În plus, Human DPP4 (DC260B), MMP9 (DMP900), CXCL10 Quantikine ELISA (DIP100) și Active MMP9 Fluorokine E Kit (F9M00, toate sistemele de cercetare și dezvoltare) au fost utilizate conform instrucțiunilor producătorului. Eliberarea lanțului ușor al neurofilamentului uman (NfL) a fost măsurată utilizând un test Meso Scale Discovery (MSD) (K1517XR-2) conform instrucțiunilor producătorului.

Extracția proteinelor

Celulele au fost clătite cu PBS și 100-200 μL de tampon RIPA rece (ThermoFisher) completat cu^TM cocktail inhibitor de protează și PhosSTOP^TM la fiecare godeu s-au adăugat inhibitori de fosfatază (ambele Merck). S-au aplicat 10 impulsuri 1s cu pistiluri acţionate de motor per probă pentru omogenizarea lizatelor. După incubare pe gheață timp de 30 de minute, probele au fost centrifugate la 12,000 rpm și 4^oC timp de 15 minute, iar supernatanții au fost depozitați la -80 °C. Cuantificarea concentrației de proteine ​​a fost efectuată folosind Pierce^TM Kit de testare a proteinei acidului bicinchoninic (ThermoFisher) conform instrucțiunilor producătorului. Probele de proteine ​​au fost apoi preparate la concentrații definite (0.3–1.0 μg/μL) prin diluare în apă distilată, NuPAGE^TM încărcarea tamponului și NuPAGE^TM agent de reducere a probei (ambele ThermoFisher). Aceasta a fost urmată de incubare la 95 °C timp de 5 minute pentru a denatura și a reduce probele.

Western Blot

5–20 μg din fiecare probă și Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder sau PageRuler™ Prestained Protein Ladder (ambele ThermoFisher) au fost încărcate pe NuPAGE prefabricat^TM Geluri cu gradient de Bis-Tris 4–12% (ThermoFisher). Probele au fost separate prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă cu dodecil sulfat de sodiu (SDS-PAGE) utilizând NuPAGE^TM Tampon de rulare MES (ThermoFisher) la 50–130 V. Proteinele au fost apoi transferate pe membranele de nitroceluloză la 20–25 V timp de 7 minute folosind un sistem de blotting iBlot 2 Dry (ambele ThermoFisher). După blocarea cu lapte 5% sau BSA în TBS/0.1% Tween-20 (TBS-T, ThermoFisher) la temperatura camerei timp de o oră, membranele au fost incubate cu anticorpii primari enumerați în tabelul suplimentar. 4 diluat în lapte 3% sau BSA în TBS-T la 4 °C peste noapte. Membranele au fost spălate de trei ori cu TBS-T timp de 7 minute și apoi incubate cu anticorpi secundari cuplați cu peroxidază de hrean (HRP) corespunzători la temperatura camerei timp de 1 oră. Au fost utilizați următorii anticorpi secundari cuplati cu HRP (toți 1:5000): HRP anti-șoarece de oaie (NA931V), HRP anti-iepure de măgar (NA934V, ambele GE Healthcare), HRP anti-capră de măgar (PA1-28664, ThermoFisher) . Membranele au fost din nou spălate de trei ori cu TBS-T timp de 7 minute și apoi incubate timp de un minut cu soluție de chemiluminiscență îmbunătățită (Millipore). ChemiDoc^TM Sistemul de imagini MP a fost folosit pentru a vizualiza semnalul. Intensitățile benzilor au fost cuantificate folosind Fiji v1.53q⁴⁵ și normalizat la genele menajere β-actină sau GAPDH și expresia medie a controalelor pentru fiecare experiment. După dezvoltare, membranele au fost spălate cu TBS-T de două ori timp de 5 minute, urmate de o incubare de 10 minute cu Restore.^TM PLUS tampon de stripare (ThermoFisher). După două spălări suplimentare de 5 minute cu TBS-T, membranele au fost blocate și incubate cu noi anticorpi primari așa cum este descris mai sus.

Analiza expresiei Poly(GA)/(GP).

Celulele au fost lizate în tampon RIPA (Sigma-Aldrich) suplimentat cu 2x Mini complet, cocktail inhibitor de protează fără EDTA (Merck) și 2% SDS (ThermoFisher) și omogenizate prin sonicare. După centrifugare la 17,000 × g la 16 °C timp de 20 de minute, conținutul de proteină al supernatanților a fost determinat așa cum este descris în Metodele suplimentare. Probele au fost ajustate la aceeași concentrație (0.6–1.0 mg/mL) și imunotestul MSD a fost efectuat în singleplex folosind plăci SECTOR cu 96 de godeuri (MSD) pentru a cuantifica expresia Poly(GA)/(GP), așa cum s-a descris anterior²⁰. Pe scurt, plăcile au fost acoperite cu anticorpi anti-poli(GP) sau anti-poli(GA) nemarcați. După blocare, probele au fost încărcate la 45 ug de proteină per godeu pentru imunotestul poli(GP) și la 27 ug de proteină pentru poli(GA). Anticorpii anti-poli(GP) și anti-poli(GA) biotinilați au fost utilizați ca detectoare, urmați de streptavidină marcată cu sulfo (Meso Scale Discovery, R32AD). Plăcile au fost citite cu tamponul de citire MSD (Meso Scale Discovery, R92TC) utilizând MSD Sector Imager 2400. Semnalele corespund intensității luminii emise la stimularea electrochimică a plăcii de testare. Înainte de analiză, valoarea medie de la un calibrator care nu conține nicio peptidă a fost scăzută din fiecare citire. Semnalele negative au fost setate la „0”.

Statistici și reproductibilitate

Nu a fost folosită nicio metodă statistică pentru a predetermina dimensiunea eșantionului. Anchetatorii au fost orbiți la alocare în timpul analizelor, dacă proiectul experimental permitea. Analizele statistice au fost efectuate folosind GraphPad Prism 9. Nu au fost excluse date din analize. Datele din mai multe linii și diferențieri au fost reunite pentru a compara efectul general al C9orf72 HRE versus controale. Comparațiile a două grupuri au fost efectuate prin teste t nepereche cu două cozi și comparații cu mai multe grupuri prin ANOVA unidirecțional sau bidirecțional cu teste post-hoc adecvate, așa cum este indicat în legendele figurilor. Numărul de experimente și linii independente este indicat în fiecare legendă a figurii. Datele sunt prezentate ca puncte de date unice și medii ± SEM. Diferențele au fost considerate semnificative când P < 0.05 (*P <0.05; **P <0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; ns: nu este semnificativ). Diagramele cu casete arată mediana (linia centrală), quartilele superioare și inferioare (limitele casetei), intervalul intercuartil de 1.5x (muștați) și valorile aberante (puncte). GraphPad Prism 9 sau RStudio 1.4.1103 au fost folosite pentru a reprezenta datele. Asamblarea finală a figurilor a fost realizată folosind Adobe Illustrator 25.4.1.

Sinteza de raportare

Informații suplimentare privind designul de cercetare sunt disponibile în Rezumatul raportării portofoliului de natură legată de acest articol.

• Distribuție de conținut bazat pe SEO și PR. Amplifică-te astăzi.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. Împuterniciți-vă. Accesați Aici.
• PlatoAiStream. Web3 Intelligence. Cunoștințe amplificate. Accesați Aici.
• PlatoESG. carbon, CleanTech, Energie, Mediu inconjurator, Solar, Managementul deșeurilor. Accesați Aici.
• PlatoHealth. Biotehnologie și Inteligență pentru studii clinice. Accesați Aici.
• Sursa: https://www.nature.com/articles/s41467-023-41603-0