Hjernen vår inneholder billioner av synapser - forbindelsene som overfører meldinger fra nevron til nevron. Innenfor disse synapsene er hundrevis av forskjellige proteiner, og funksjonssvikt av disse proteinene kan føre til tilstander som schizofreni og autisme.

Forskere ved MIT og Broad Institute of MIT og Harvard har nå utviklet en ny måte å raskt avbilde disse synaptiske proteinene med høy oppløsning. Ved å bruke fluorescerende nukleinsyreprober kan de merke og avbilde et ubegrenset antall forskjellige proteiner. De demonstrerte teknikken i en ny studie der de avbildet 12 proteiner i cellulære prøver som inneholder tusenvis av synapser.

"Multiplexed imaging er viktig fordi det er så mye variasjon mellom synapser og celler, selv innenfor samme hjerne," sier Mark Bathe, en MIT førsteamanuensis i biologisk ingeniørfag. "Du må virkelig se på proteiner i prøven samtidig for å forstå hvordan underpopulasjoner av forskjellige synapser ser ut, oppdage nye typer synapser og forstå hvordan genetiske variasjoner påvirker dem."

Forskerne planlegger å bruke denne teknikken ved siden av å studere hva som skjer med synapser når de blokkerer ekspresjonen av gener assosiert med spesifikke sykdommer, i håp om å utvikle nye behandlinger som kan reversere disse effektene.

Bathe og Jeff Cottrell, direktør for translasjonsforskning ved Stanley Center for Psychiatric Research ved Broad Institute, er seniorforfatterne av studien, som vises i dag i Nature Communications. Hovedforfatterne av artikkelen er tidligere postdoktorer Syuan-Ming Guo og Remi Veneziano, tidligere doktorgradsstudent Simon Gordonov og tidligere forsker Li Li.

Avbildning med DNA

Synaptiske proteiner har en rekke funksjoner. Mange av dem bidrar til å danne synaptiske stillaser, som er involvert i å skille ut nevrotransmittere og behandle innkommende signaler. Mens synapser inneholder hundrevis av disse proteinene, er konvensjonell fluorescensmikroskopi begrenset til å avbilde maksimalt fire proteiner om gangen.

For å øke dette tallet utviklet MIT-teamet en ny teknikk basert på en eksisterende metode kalt DNA PAINT. Ved å bruke denne metoden, opprinnelig utviklet av Ralf Jungmann fra Max Planck Institute of Biochemistry, merker forskere proteiner eller andre molekyler av interesse med en DNA-antistoffprobe. Deretter avbilder de hvert protein ved å levere en fluorescerende DNA-"oligo" som binder seg til DNA-antistoffprobene.

DNA-trådene har en iboende lav affinitet for hverandre, så de binder seg og avbindes med jevne mellomrom, og skaper en blinkende fluorescens som kan avbildes ved hjelp av superoppløsningsmikroskopi. Imidlertid tar bildebehandling av hvert protein omtrent en halvtime, noe som gjør det upraktisk å avbilde mange proteiner i en stor prøve.

Bathe og kollegene hans forsøkte å lage en raskere metode som ville tillate dem å analysere et stort antall prøver på kort tid. For å oppnå det, endret de DNA-fargestoff-avbildningssonden slik at den ville binde seg tettere til DNA-antistoffet ved å bruke det som kalles låste nukleinsyrer. Dette gir et mye lysere signal, slik at bildebehandlingen kan gjøres raskere, men med litt lavere oppløsning.

"Når vi gjør 12 eller 15 farger på en enkelt brønn med nevroner, tar hele eksperimentet en time, sammenlignet med over natten for ekvivalenten med superoppløsning," sier Bathe.

Forskerne brukte denne teknikken til å merke 12 forskjellige proteiner som finnes i synapsen, inkludert stillasproteiner, proteiner assosiert med cytoskjelettet og proteiner som er kjent for å markere eksitatoriske eller hemmende synapser. Et av proteinene de så på er shank3, et stillasprotein som har vært knyttet til begge autisme og schizofreni.

Ved å analysere proteinnivåer i tusenvis av nevroner, var forskerne i stand til å bestemme grupper av proteiner som har en tendens til å assosieres med hverandre oftere enn andre, og å lære hvordan forskjellige synapser varierer i proteinene de inneholder. Den typen informasjon kan brukes til å klassifisere synapser i undertyper som kan bidra til å avsløre funksjonene deres.

"Hemmende og eksitatoriske er de kanoniske synapsetypene, men det er spekulert i at det er mange forskjellige undertyper av synapser, uten noen reell konsensus rundt hva de er," sier Bathe.

Forstå sykdom

Forskerne viste også at de kunne måle endringer i synaptiske proteinnivåer som oppstår etter at nevroner er behandlet med en forbindelse kalt tetrodotoksin (TTX), som styrker synaptiske forbindelser.

"Ved bruk av konvensjonell immunfluorescens kan du vanligvis trekke ut informasjon fra tre eller fire mål i samme prøve, men med vår teknikk klarte vi å utvide det antallet til 12 forskjellige mål i samme prøve. Vi brukte denne metoden for å undersøke synaptisk ombygging som skjer etter behandling med TTX, og funnene våre bekreftet tidligere arbeid som avslørte en koordinert oppregulering av synaptiske proteiner etter TTX-behandling, sier Eric Danielson, en MIT senior postdoc som er forfatter av studien.

Forskerne bruker nå denne teknikken, kalt PRISM, for å studere hvordan strukturen og sammensetningen av synapser påvirkes av å slå ned et sett med gener rapportert tidligere for å gi genetisk risiko for utvikling av psykiatriske lidelser. Sekvensering av genomene til mennesker med lidelser som autisme og schizofreni har avslørt hundrevis av sykdomskoblede genvarianter, og for de fleste av disse variantene har forskerne ingen anelse om hvordan de bidrar til sykdom.

"Med denne tilnærmingen forventer vi å gi en mer detaljert oversikt over endringene i synaptisk organisering og delte sykdomseffekter assosiert med disse genene," sier Karen Perez de Arce, en forsker ved Broad Institute og forfatter av studien.

"Å forstå hvordan genetisk variasjon påvirker nevronenes utvikling i hjernen, og deres synaptiske struktur og funksjon, er en stor utfordring innen nevrovitenskap og i å forstå hvordan disse sykdommene oppstår," legger Bathe til.

Forskningen ble finansiert av National Institutes of Health, inkludert NIH BRAIN Initiative, National Science Foundation, Howard Hughes Medical Institute Simons Faculty Scholars Program, Open Philanthropy Project, US Army Research Laboratory, New York Stem Cell Foundation Robertson Award, og Stanley Center for Psychiatric Research.

Andre forfattere av artikkelen inkluderer MIT-forsker Demian Park, tidligere MIT-student Anthony Kulesa og MIT postdoc Eike-Christian Wamhoff. Paul Blainey, førsteamanuensis i biologisk ingeniørfag og medlem av Broad Institute, og Edward Boyden, Y. Eva Tan-professor i nevroteknologi og førsteamanuensis i biologisk ingeniørfag og hjerne- og kognitivvitenskap, er også forfattere av studien.