Etikkerklæring

Alle iPSC-linjene ble tidligere avledet fra hudbiopsifibroblaster, etter signert informert samtykke, samlet inn under etisk godkjenning gitt av South Wales Research Ethics Committee (WA/12/0186) og South Central Berkshire Research Ethics Committee (REC10/H0505/71) i James Martin Stem Cell Facility, University of Oxford, under standardiserte protokoller. iPSC-linjene har alle blitt publisert tidligere (se nedenfor og tilleggstabell 1).

iPSC kultur

Tre iPSC-linjer avledet fra tre forskjellige ALS-pasienter som bærer en HRE inn C9orf72 og som kontroller, en isogen linje, tidligere generert gjennom CRISPR/Cas9 genomredigering ved bruk av homologirettet reparasjon¹⁸, og fire kjønns- og alderstilpassede sunne kontroll-iPSC-linjer, ble brukt i denne studien. Alle iPSC-linjer har tidligere blitt publisert og omfattende karakterisert (for detaljer om demografi og karakterisering, se tilleggstabell 1). iPSC ble dyrket i mTeSR™1 (85850, StemCell Technologies) på Geltrex™ (A1413302, ThermoFisher) med daglige mediumskift. Celler ble passert ved bruk av EDTA (0.5 mM), utvidet for å produsere konsistente, frosne cellebestander for studien (kryopreservert i 50 % mTeSR™1, 30 % embryonalt stamcellefosterserum (16141002, Merck), 10 % KnockOut™ DMEM ( 10829018, ThermoFisher), 10 % DMSO (D2650, Merck)) med maksimalt 3 påfølgende passasjer under eksperimentering, og testet negativt for mykoplasma ved bruk av MycoAlert^TM Mycoplasma Detection Kit (Lonza).

Differensiering av iPSC-avledede motoriske nevroner

iPSC ble differensiert til MN-er ved å bruke en tidligere publisert protokoll³⁹. Kort fortalt ble neural induksjon utført ved bruk av DMEM-F12/Neurobasal 50:50 supplert med N2 (1X), B27 (1X), 2-Mercaptoethanol (1X), Antibiotikum-Antimycotic (1X, alle ThermoFisher), askorbinsyre (0.5 μM) , forbindelse C (1 μM, begge Merck) og Chir99021 (3 μM, FoU-systemer). Etter to dager i kultur ble Retinoic Acid (1 μM, Merck) og Smoothened Agonist (500 nM, R&D Systems) tilsatt. Etter ytterligere 2 dager ble forbindelse C og Chir99021 fjernet. På dag in vitro (DIV)18 ble cellene utplatet på nytt på polyetylenimin (PEI, 0.07%, Merck) og Geltrex™ (ThermoFisher) eller PDL (Sigma-Aldrich)/Laminin (FoU-systemer)/Fibronectin (Corning) i medium i tillegg supplert med BDNF (10 ng/mL), GDNF (10 ng/mL), Laminin (0.5 μg/mL, alt ThermoFisher) og DAPT (10 μM, FoU-systemer). Tre dager senere ble mediet endret til mikroglia-medium som beskrevet nedenfor, og MN-er ble enten samdyrket med mikroglia eller holdt i monokultur. Halve medium endringer ble utført hver 2.–4. dag.

Differensiering av iPSC-avledede mikroglia-forløpere

iPSC ble differensiert til makrofag/mikroglia-forløpere som beskrevet tidligere^15,40. Kort fortalt ble embryoid kroppsdannelse (EB) indusert ved å så iPSC inn i Aggrewell 800 brønner (STEMCELL Technologies) i mTeSR™1 supplert med BMP4 (50 ng/ml), VEGF (50 ng/ml, begge Peprotech) og SCF (20) ng/ml, Miltenyi Biotec). Etter fire til syv dager med daglige ¾ medium endringer, ble EB-er overført til T175-kolber og differensiert i X-VIVO15 (Lonza), supplert med Interleukin-3 (25 ng/mL, FoU-systemer), MCS-F (100 ng/mL) ), GlutaMAX (1X, begge ThermoFisher) og 2-Mercaptoethanol (1X). Frisk medium ble tilsatt ukentlig. Etter omtrent to måneder ble forløpere høstet ved å samle supernatanten, ført gjennom en cellesil (40 μM, Falcon/Greiner), og enten differensiert til mikroglia i monokultur eller samkultur som beskrevet nedenfor.

Differensiering av iPSC-avledet mikroglia

Microglia-forløpere ble belagt på PEI (0.07%) og Geltrex™ eller PDL/Laminin/Fibronectin ved å bruke vårt tidligere karakteriserte microglia-medium¹⁷ består av Advanced DMEM-F12 (ThermoFisher), GlutaMAX (1X), N2 (1X), Antibiotikum-Antimycotic (1X), 2-Mercaptoethanol (1X), Interleukin-34 (100 ng/mL, Peprotech/BioLegend), BDNF ( 10 ng/mL), GDNF (10 ng/mL) og Laminin (0.5 μg/mL). Microglia ble differensiert i omtrent 14 dager, med halve medium endringer hver 2.–4. dag, og samlet inn for RNA/proteinekstraksjon eller brukt til analyser.

Samkultur av iPSC-avledede motoriske nevroner og mikroglia

Ko-kulturer ble generert som beskrevet før ved bruk av HC-2b-linjen (tilleggstabell 1) for å generere MN-er¹⁷. Kort fortalt, tre dager etter den endelige re-pletteringen av differensierende MN-er (DIV21), ble mikroglia-forløpere høstet. MN-er ble skylt med PBS, og mikroglia-forløpere resuspendert i mikroglia-medium ble tilsatt til hver brønn i et 1:1-forhold med MN-ene. Samkulturer ble opprettholdt i minst 14 dager, med halve medium endringer hver 2.–4. dag. I utvalgte eksperimenter ble direkte kontakt mellom de to celletypene forhindret ved å utplate mikroglia i vevskulturinnsatser (0.4 µm porestørrelse, 83.3932.040, Sarstedt).

Priming av mikroglia med LPS- og MMP9-hemmerbehandling

For mikrogliale monokulturer ble alt medium aspirert, og LPS (100 ng/ml, L4391, Merck) i mikroglia medium ble tilsatt i 48 timer. Kontrollbrønner mottok kun ferskt mikroglia-medium. Under utvalgte forhold ble det utført repeterende LPS-behandlinger på dag 0, 2 og 4. For samkulturer ble LPS-behandlinger startet på DIV25 og utført i 10 dager. Halvparten av mediet ble aspirert og erstattet med LPS i mikroglia medium (sluttkonsentrasjon: 100 ng/mL), med ytterligere halve medium endringer med LPS-holdig mikroglia medium på DIV29 og 33. I ytterligere eksperimenter ble LPS behandlinger startet på DIV25 og utført i 20 dager, med halve medieskift annenhver dag. BDNF og GDNF ble fjernet fra kulturmediet for disse eksperimentene. For å hemme MMP9 ble kulturer samtidig behandlet med LPS (100 ng/ml) og MMP9-hemmer I (MMP9i, 3 μM, 444278, Merck) eller DMSO i like konsentrasjoner (0.3%) som vehikelkontroll.

Priming av mikroglia med TNF/IL1B

Alt medium ble aspirert fra mikroglia-monokulturer, og TNF (50 ng/ml) og IL1B (20 ng/ml, begge Peprotech) i mikroglia-medium ble tilsatt i 48 timer. Kontrollbrønner mottok kun ferskt mikroglia-medium.

Behandling av MN-er med rhMMP9- og MMP9-hemmer

MN-er ble behandlet med rekombinant aktiv human MMP9 (rhMMP9, 30 ng/ml, PF024-5UG, Merck) og MMP9i (3 μM, 444278, Merck) eller DMSO i like konsentrasjoner (0.3 %) som vehikelkontroll. Behandlinger ble utført på DIV21 og DIV25, og MN-levedyktighet ble bestemt ved MTS-analyse på DIV29.

Live-avbildning av fagocytose og kvantifisering

Ustimulerte og LPS-primede (100 ng/mL i 48 timer) mikrogliale monokulturer ble farget med Hoechst i Live Cell Imaging Solution (1:10,000 10, ThermoFisher) i 35364 min. pHrodo™ Red Zymosan Bioparticles™ (P50, ThermoFisher) i Live Cell Imaging Solution (150 µg/ml) ble tilsatt til hver brønn og bilder ble tatt etter 10 minutter ved bruk av et EVOS™ XL Core Cell Imaging System (ThermoFisher) utstyrt med en 10x objektiv. Under utvalgte forhold ble cellene i tillegg behandlet med fagocytose/nedbrytningshemmerne Cytochalasin D (2618 μM, C1, Merck), Bafilomycin A1 (1334 μM, 1, R&D Systems), eller DMSO (vehikel), med en XNUMX times forbehandling. Kvantifisering ble utført automatisk ved bruk av en analysemakro i Fiji og arealet av fagocytosepartikler per celle ble oppnådd ved å dele arealet til de internaliserte fagocytosepartiklene med antall Hoechst-positive mikroglia.

Patch-clamp elektrofysiologi

Helcelle patch-clamp elektrofysiologi ble utført som beskrevet tidligere¹⁷. Sunne kontroll-MN-er på DIV 42–46 i samkultur med sunn kontroll eller C9orf72-ALS pasientavledet mikroglia ble opprettholdt i en ekstracellulær løsning som inneholdt 167 mM NaCl, 2.4 mM KCl, 1 mM MgCl₂10 mM glukose, 10 mM HEPES og 2 mM CaCl₂ justert til en pH på 7.4 og 300 mOsm. Elektroder med spissmotstander mellom 7 og 12 MΩ ble produsert av borosilikatglass (0.86 mm indre diameter; 1.5 mm ytre diameter). En intracellulær løsning ble tilsatt til elektroden inneholdende 140 mM K-glukonat, 6 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM MgATP, 0.5 mM Na₃GTP, justert til pH 7.3 og 290 mOsm. Datainnsamling ble utført ved bruk av en Multiclamp 700B forsterker, digidata 1550 A og clampEx 6 programvare. Seriemotstand (R_s) ble holdt ved <30 MΩ. Spenningsgatede kanalstrømmer ble målt på spenningsklemme hvor nevroner ble forhåndspulsert i 250 ms med -140 mV puls og en 10 mV-trinns spenning ble påført fra -70 mV til +70 mV. Induserte aksjonspotensialer (AP) ble registrert på strømklemme, nevroner ble holdt ved -70 mV og 15 strømtrinn på 10 pA ble påført fra -10 pA til 130 pA. Spenningsgatede kanalstrømmer og egenskaper til induserte aksjonspotensialer (rheobase, max APs, APs over rheobase) ble kvantifisert ved å bruke Clampfit 10.3 (pCLAMP Software suite, Molecular Devices). Maks AP-er ble kvantifisert ved å bestemme antall AP-er i sveip med det lengste toget. AP-varighet og amplitude ble kvantifisert i Matlab R2022a (MathWorks) ved å bruke det første aksjonspotensialet registrert fra hver nevron.

MEA-opptak

I alt ble 2–15 minutters registreringer av neuronal aktivitet oppnådd for samkulturer i 48-brønns multi-electrode array (MEA) plater (M768-tMEA-48B, Axion BioSystems) ved bruk av Maestro-systemet (Axion Biosystems). Analyse ble utført ved å bruke AXIS-programvaren v2.5.2 (Axion BioSystems) med SD > 5.5 som deteksjonsterskel. Gjennomsnittlig avfyringshastighet per brønn ble beregnet ved å beregne gjennomsnittet av alle aktive (>1 pigg/min) elektroder per brønn.

RNA-isolering og RT-qPCR

RNA ble ekstrahert ved bruk av et RNAeasy Mini Plus-sett (Qiagen) og like mengder RNA (100 ng) ble reverstranskribert til cDNA ved bruk av High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (ThermoFisher). Kvantitativ sanntids-PCR ble utført med Fast SYBR™ Green Master Mix (ThermoFisher) ved bruk av et LightCycler® 480 PCR-system (Roche) og primerne (ThermoFisher) oppført i tilleggstabell 3. Alle settene ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Kvantifisering av det relative fold-genuttrykket ble utført ved å bruke 2^–∆∆Ct metode med normalisering til TBP referansegen (TBP Ct-område 0.5) og gjennomsnittlig genuttrykk for kontrollmikroglia for hvert eksperiment.

RNA-sekvensering

Tre sunne kontroll- og tre C9orf72-ALS-pasientavledede iPSC-linjer ble differensiert til mikroglia, med tre uavhengige differensieringer per linje. RNA ble ekstrahert som beskrevet ovenfor. Alle RNA-prøver viste RIN-verdier på minst 8.5. Preparering av prøver og bioinformatisk analyse ble deretter utført som beskrevet tidligere¹⁷. Kort fortalt ble prøvene normalisert til 100 ng før bibliotekpreparering. Polyadenylert transkriptberikelse og strengspesifikk bibliotekfremstilling ble fullført ved å bruke NEBNext Ultra II mRNA-settet (NEB) etter produsentens instruksjoner. Paret endesekvensering (leselengde: 150 basepar) ble utført ved bruk av en NovaSeq6000-plattform (Illumina, NovaSeq 6000 S2/S4 reagenssett, v1.5, 300 sykluser), og genererte et ubehandlet antall avlesninger på minimum 30 M avlesninger per prøve . Parede avlesninger ble kartlagt til det humane GRCh38.p13 referansegenomet (https://www.gencodegenes.org) bruker HISAT2 v2.2.1⁴¹. Telletabellen ble hentet med FeatureCounts v2.0.1⁴². Normalisering av tellinger og differensiell ekspresjonsanalyse ble utført ved bruk av DESeq2 v1.28.1⁴³ i RStudio 1.4.1103, inkludert biologisk kjønn i modellen og med Benjamini-Hochberg-metoden for multiple testing korreksjon. De tre forskjellige differensieringene per tilstand ble kollapset til ett datapunkt med mindre annet er angitt der det biologiske kjønn og differensieringsreplikatet var inkludert i modellen. Utforskende dataanalyse ble utført etter variansstabiliserende transformasjon av telletabellen, ved bruk av hovedkomponentanalyse. Logg₂ fold endring (logg₂ fc) krymping ble utført ved bruk av "normal" tilnærming. Gener med | Logg₂ fc| > 0.5 og justert p-verdi < 0.05 ble definert som differensielt uttrykte gener (DEG). Data ble tolket med merknader fra Gene Ontology-databasen ved bruk av clusterProfiler v3.16.1⁴⁴. Vi analyserte baneberikelse ved å utføre overrepresentasjonsanalyse (ORA) for alle DEG-er og gensettanrikningsanalyser (GSEA) på hele transkriptomet rangert etter log₂fc, ved å bruke standardinnstillingene i clusterProfiler for ORA og GSEA (justert p-verdi < 0.05 ved bruk av Benjamini-Hochberg-metoden).

Immunfluorescens

Celler dyrket på dekkglass ble forhåndsfiksert med 2% paraformaldehyd (PFA) i PBS i 2 minutter ved romtemperatur (RT) og deretter fiksert med 4% PFA i PBS i ytterligere 15 minutter ved RT. Etter permeabilisering og blokkering med 5 % eselserum og 0.2 % Triton X-100 i PBS i 1 time ved romtemperatur, ble dekkglassene inkubert med de primære antistoffene oppført i tilleggstabell 2, fortynnet i 1 % eselserum og 0.1 % Triton X-100 i PBS, ved 4 °C PÅ. Etter tre vaskinger med PBS-0.1 % Triton X-100 i 5 minutter hver, ble dekkglass inkubert med tilsvarende fluorescerende sekundære antistoffer Alexa Fluor® 488/568/647 esel-anti-mus/kanin/geit/marsvin (alle 1:1000, ThermoFisher eller Abcam). Dekkglass ble deretter vasket to ganger med PBS-0.1 % Triton X-100 i 5 minutter hver og inkubert med DAPI (1 µg/ml, Sigma-Aldrich) i PBS i 10 minutter. Etter ytterligere 5 minutters vasketrinn med PBS-0.1 % Triton X-100, ble dekkglassene montert på mikroskopiglass ved bruk av ProLong™ Diamond, Gold eller Glass Antifade Mountant (ThermoFisher). Konfokalmikroskopi ble utført ved bruk av et LSM 710, LSM 880 (begge Zeiss) eller Fluoview FV1000 (Olympus) mikroskop.

Analyse av mikrogliale forgreninger

Fire til fem z-stack-bilder (z-intervall: 1 μm) av tilfeldig utvalgte synsfelt ble tatt med 60x forstørrelse for hvert dekkglass, og projeksjoner med maksimal intensitet ble generert i Fiji. For å analysere forgreningen av IBA1-positive mikroglia i monokultur og samkultur, ble cellevolumet, forgreningsindeksen, gjennomsnittlig grenlengde og antall grenpunkter automatisk bestemt ved bruk av 3DMorph som beskrevet andre steder¹⁹.

Kvantifisering av TDP-43 feillokalisering i mikroglia

Fire til fem z-stack-bilder av tilfeldig utvalgte synsfelt ble tatt med 60x forstørrelse for hvert dekkglass, og projeksjoner med maksimal intensitet ble generert i Fiji. De gjennomsnittlige intensitetsverdiene for TDP-43 i kjernen og cytoplasma ble bestemt på en blind måte, med DAPI- og IBA1-signalet som ble brukt til å identifisere henholdsvis kjernefysiske og cytoplasmatiske grenser. Forholdet mellom cytoplasmatisk og nukleær TDP-43 ble deretter beregnet.

Kvantifisering av mikroglia-markøruttrykk i mikroglia-monokulturer

Tre z-stack-bilder av tilfeldig utvalgte synsfelt ble tatt med 40x forstørrelse for hvert dekkglass, og projeksjoner med maksimal intensitet ble generert i Fiji. Antall DAPI-positive kjerner og IBA1⁺/DAPI⁺ og TMEM119⁺/DAPI⁺ celler ble automatisk kvantifisert per visningsfelt for hver linje ved hjelp av en makro.

Kvantifisering av antall mikroglia og motorneuroner og forhold i samkultur

Tre til fem z-stack-bilder av tilfeldig utvalgte synsfelt ble tatt med 10x eller 40x forstørrelse for hvert dekkglass, og maksimal intensitetsprojeksjoner ble generert i Fiji. For mikroglia, ved bruk av en makro, ble en autoterskel brukt på IBA1-kanalen for å lage en maske, og antall mikrogliaceller ble bestemt for hvert visningsfelt ved å telle antall DAPI-positive kjerner i IBA1-masken ved å bruke 'analysen partiklers funksjon. For MN-er ble en autoterskel brukt på TUJ1-kanalen for å lage en maske, og antall nevroner ble bestemt for hvert synsfelt ved å telle antall DAPI-positive kjerner i TUJ1-masken ved å bruke funksjonen 'analysere partikler'. For å beregne mikroglia:MN-forholdet ble antallet mikrogliaceller delt på MN-tallet. For vurdering av MN-overlevelse etter langvarig LPS-eksponering ble det absolutte MN-tallet normalisert til gjennomsnittet av kontrolllinjene for å bestemme den relative MN-overlevelsen ved å ta hensyn til batcheffekter mellom differensieringer etter langtidsdyrking.

Kvantifisering av apoptotisk markøruttrykk i samkultur

Fem z-stabler bilder av tilfeldig valgte synsfelt ble tatt med 40x forstørrelse for hvert dekkglass. Maksimal intensitetsprojeksjoner ble generert. Ved å bruke en makro ble en autoterskel brukt på TUJ1-kanalen for å lage en maske, og uttrykket av den CC3-apoptotiske markøren i nevroner ble bestemt for hvert synsfelt ved å kvantifisere området til CC3-signalet i TUJ1-masken ved å bruke 'analysen partiklers funksjon. For å ta hensyn til batcheffekter mellom differensieringer, ble foldendringen i uttrykk generert ved å normalisere de absolutte målingene til gjennomsnittet av kontrolllinjene.

Kvantifisering av neurittutvekst i samkultur

Fire til fem z-stabler med tilfeldig utvalgte synsfelt som viser neuritter, men unngår nevronale somas, ble oppnådd ved 60x forstørrelse for hvert dekkglass. Maksimal intensitetsprojeksjoner ble generert i Fiji. Ved å bruke en makro ble en autoterskel brukt på TUJ1-fargingen, og neurittutveksten for hvert synsfelt ble bestemt ved å måle arealet av TUJ1-positive neuritter per synsfelt ved å bruke funksjonen 'analysere partikler' i Fiji.

Analyse av neuronalt synaptofysinuttrykk

Fire til fem z-stabler bilder av tilfeldig utvalgte synsfelt ble tatt med 60x forstørrelse for hvert dekkglass. Maksimal intensitetsprojeksjoner ble generert i Fiji. Ved å bruke en makro ble en autoterskel brukt på synaptophysin-fargingen for å analysere prikklignende strukturer, og antallet og arealet av synaptophysin-partikler ble bestemt for hvert synsfelt ved å bruke funksjonen 'analysere partikler' i Fiji.

RNAscope

RNA foci ble påvist ved bruk av RNAscope Multiplex Fluorescent v2 Assay (323100, ACD) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble iPSC mikroglia fiksert med 4% PFA sekvensielt dehydrert med 50%, 70% og 100% etanol i 1 min hver, og lagret ved -20 °C. Etter rehydrering med 100 %, 70 % og 50 % etanol, ble cellene inkubert med 0.1 % Tween-20 i PBS, hydrogenperoksid og protease III (fortynningsforhold 1:15) i 10 minutter hver, med PBS-vasker i mellom. Sonder rettet mot (G₄C₂)_n og (C₄G₂)_n utvidelser (ACD, 884351-C2 og 884361-C2) ble lagt til separate dekkglass og inkubert i 2 timer, etterfulgt av amplifikasjons- og utviklingstrinn i henhold til standardprotokollen. Sekvensiell ICC ble utført ved inkubering med primært antistoff mot IBA1 (1:200, 019-19741, Wako Fujifilm) i 2 timer ved RT og deretter i henhold til immunfluorescensprotokollen beskrevet ovenfor.

Kvantifisering av RNA-foci-dannelse i mikroglia

Fem z-stack-bilder av tilfeldig utvalgte synsfelt ble tatt med 40x eller 63x forstørrelse for hvert dekkglass, og maksimal intensitetsprojeksjoner ble generert i Fiji. Antall foci-positive celler og antall foci per foci-positive kjerne ble bestemt ved manuell telling.

MTS levedyktighetsanalyse

I utvalgte eksperimenter ble MN-levedyktighet bestemt ved bruk av CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS, G3580, Promega) i henhold til produsentens instruksjoner. Plateavlesninger ble utført etter 90–120 min inkubering med analysereagenser.

Måling av cytokin/kjemokin og neurofilamentfrigjøring

Kultursupernatanter ble samlet og sentrifugert ved 1200 xg og 4 °C i 10 minutter. Samlede prøver ble analysert ved å bruke Proteome Profiler Human XL Cytokine Array (ARY022B) eller Protease/Protease Inhibitor Array (ARY025, begge R&D-systemer) i henhold til produsentens instruksjoner. Signalet ble visualisert på en ChemiDoc^TM MP-bildesystem (Bio-Rad) og analysert ved hjelp av ImageStudioLite v5.2.5 (LI-COR). I tillegg ble Human DPP4 (DC260B), MMP9 (DMP900), CXCL10 Quantikine ELISA (DIP100) og Active MMP9 Fluorokine E Kit (F9M00, alle R&D-systemer) brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Human neurofilament light chain (NfL) frigjøring ble målt ved å bruke en Meso Scale Discovery (MSD) analyse (K1517XR-2) i henhold til produsentens instruksjoner.

Proteinekstraksjon

Celler ble skylt med PBS, og 100–200 μL kald RIPA-buffer (ThermoFisher) supplert med komplett^TM proteasehemmercocktail og PhosSTOP^TM fosfataseinhibitor (begge Merck) ble tilsatt til hver brønn. 10 1s-impulser med motordrevne stamper ble påført per prøve for å homogenisere lysatene. Etter inkubering på is i 30 minutter ble prøvene sentrifugert ved 12,000 4 rpm og XNUMX^oC i 15 minutter, og supernatantene ble lagret ved -80 °C. Kvantifisering av proteinkonsentrasjonen ble utført ved bruk av Pierce^TM Bicinchoninsyreproteinanalysesett (ThermoFisher) i henhold til produsentens instruksjoner. Proteinprøver ble deretter preparert i definerte konsentrasjoner (0.3–1.0 μg/μL) ved fortynning i destillert vann, NuPAGE^TM lastebuffer og NuPAGE^TM prøvereduksjonsmiddel (begge ThermoFisher). Dette ble fulgt av inkubering ved 95 °C i 5 minutter for å denaturere og redusere prøvene.

Western blot

5–20 μg av hver prøve og Spectra Multicolour Broad Range Protein Ladder eller PageRuler™ Pretained Protein Ladder (begge ThermoFisher) ble lastet på forhåndsstøpt NuPAGE^TM Bis-Tris 4–12 % gradientgeler (ThermoFisher). Prøvene ble separert ved natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) ved bruk av NuPAGE^TM MES-løpebuffer (ThermoFisher) ved 50–130 V. Proteiner ble deretter overført til nitrocellulosemembraner ved 20–25 V i 7 minutter ved bruk av et iBlot 2 Dry blotting-system (begge ThermoFisher). Etter blokkering med 5 % melk eller BSA i TBS/0.1 % Tween-20 (TBS-T, ThermoFisher) ved RT i én time, ble membraner inkubert med de primære antistoffene oppført i tilleggstabell 4 fortynnet i 3 % melk eller BSA i TBS-T ved 4 °C over natten. Membraner ble vasket tre ganger med TBS-T i 7 minutter og deretter inkubert med tilsvarende pepperrotperoksidase (HRP)-koblede sekundære antistoffer ved romtemperatur i 1 time. Følgende HRP-koblede sekundære antistoffer (alle 1:5000) ble brukt: sau-anti-mus HRP (NA931V), esel-anti-kanin HRP (NA934V, begge GE Healthcare), esel-anti-geit HRP (PA1-28664, ThermoFisher) . Membraner ble igjen vasket tre ganger med TBS-T i 7 minutter og deretter inkubert i ett minutt med forsterket kjemiluminescensløsning (Millipore). ChemiDoc^TM MP-bildesystem ble brukt for å visualisere signalet. Båndintensiteter ble kvantifisert ved å bruke Fiji v1.53q⁴⁵ og normalisert til husholdningsgenene β-aktin eller GAPDH og gjennomsnittlig uttrykk for kontrollene for hvert eksperiment. Etter utvikling ble membranene vasket med TBS-T to ganger i 5 minutter, etterfulgt av en 10 minutters inkubering med Restore^TM PLUSS strippebuffer (ThermoFisher). Etter ytterligere 5 minutters vask med TBS-T, ble membraner blokkert og inkubert med nye primære antistoffer som beskrevet ovenfor.

Analyse av Poly(GA)/(GP)-uttrykk

Celler ble lysert i RIPA-buffer (Sigma-Aldrich) supplert med 2x komplett Mini, EDTA-fri proteasehemmercocktail (Merck) og 2% SDS (ThermoFisher) og homogenisert ved sonikering. Etter sentrifugering ved 17,000 XNUMX × g ved 16 °C i 20 minutter, ble proteininnholdet i supernatantene bestemt som beskrevet i tilleggsmetodene. Prøvene ble justert til samme konsentrasjon (0.6–1.0 mg/ml) og MSD-immunoanalyse ble utført i singleplex ved bruk av 96-brønners SECTOR-plater (MSD) for å kvantifisere Poly(GA)/(GP)-ekspresjon, som beskrevet tidligere²⁰. Kort fortalt ble plater belagt med umerkede anti-poly(GP) eller anti-poly(GA) antistoffer. Etter blokkering ble prøver lastet med 45 µg protein per brønn for poly(GP)-immunanalysen og med 27 µg protein for poly(GA). Biotinylerte anti-poly(GP) og anti-poly(GA) antistoffer ble brukt som detektorer, etterfulgt av sulfo-merket streptavidin (Meso Scale Discovery, R32AD). Platene ble lest med MSD-lesebufferen (Meso Scale Discovery, R92TC) ved bruk av MSD ​​Sector Imager 2400. Signaler tilsvarer intensiteten av utsendt lys ved elektrokjemisk stimulering av analyseplaten. Før analysen ble gjennomsnittsavlesningen fra en kalibrator som ikke inneholdt noe peptid trukket fra hver avlesning. Negative signaler ble satt til '0'.

Statistikk og reproduserbarhet

Ingen statistisk metode ble brukt for å forhåndsbestemme prøvestørrelse. Undersøkere ble blindet for tildeling under analyser hvis det var tillatt av det eksperimentelle designet. Statistiske analyser ble utført med GraphPad Prism 9. Ingen data ble ekskludert fra analysene. Data fra flere linjer og differensieringer ble samlet for å sammenligne den samlede effekten av C9orf72 HRE versus kontroller. Sammenligninger av to grupper ble utført ved to-halede uparrede t-tester og flere gruppesammenlikninger ved en- eller toveis ANOVA med passende post-hoc-tester som angitt i figurforklaringene. Antall uavhengige eksperimenter og linjer er angitt i hver figurforklaring. Data presenteres som enkeltdatapunkter og gjennomsnitt ± SEM. Forskjeller ble ansett som betydelige når P < 0.05 (*P <0.05; **P <0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; ns: ikke signifikant). Boksplott viser medianen (senterlinje), øvre og nedre kvartiler (boksgrenser), 1.5x interkvartilområde (værhår) og uteliggere (punkter). GraphPad Prism 9 eller RStudio 1.4.1103 ble brukt til å plotte data. Den endelige sammenstillingen av figurer ble utført ved hjelp av Adobe Illustrator 25.4.1.

Rapporteringssammendrag

Mer informasjon om forskningsdesign er tilgjengelig i Sammendrag av naturporteføljerapportering knyttet til denne artikkelen.

• SEO-drevet innhold og PR-distribusjon. Bli forsterket i dag.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. Styrk deg selv. Tilgang her.
• PlatoAiStream. Web3 Intelligence. Kunnskap forsterket. Tilgang her.
• PlatoESG. Karbon, CleanTech, Energi, Miljø, Solenergi, Avfallshåndtering. Tilgang her.
• PlatoHelse. Bioteknologisk og klinisk etterretning. Tilgang her.
• kilde: https://www.nature.com/articles/s41467-023-41603-0