Ribonucleïnezuur (RNA) is de sleutel tot verschillende fundamentele biologische processen. Het draagt ​​genetische informatie over, vertaalt deze in eiwitten of ondersteunt genregulatie. Om een ​​meer gedetailleerd begrip te krijgen van de precieze functies die het uitvoert, hebben onderzoekers van de Universiteit van Heidelberg en van het Karlsruhe Institute of Technology (KIT) een nieuwe fluorescentie-beeldvormingsmethode ontwikkeld die RNA-beeldvorming van levende cellen mogelijk maakt met een ongekende resolutie.

De methode is gebaseerd op een nieuwe moleculaire marker genaamd Rhodamine-Binding Aptamer for Super-Resolution Imaging Techniques (RhoBAST). Deze op RNA gebaseerde fluorescentiemerker wordt gebruikt in combinatie met de kleurstof rhodamine. Vanwege hun onderscheidende eigenschappen werken marker en kleurstof op een zeer specifieke manier samen, waardoor individuele RNA-moleculen gloeien. Ze kunnen vervolgens zichtbaar worden gemaakt met behulp van single-molecule lokalisatiemicroscopie (SMLM), een beeldvormingstechniek met superresolutie. Door een gebrek aan geschikte fluorescentiemerkers is directe waarneming van RNA via optische fluorescentiemicroscopie tot op heden ernstig beperkt.

RhoBAST is ontwikkeld door onderzoekers van het Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology (IPMB) aan de Heidelberg University en het Institute of Applied Physics (APH) aan het KIT. De door hen gecreëerde marker is genetisch codeerbaar, wat betekent dat het kan worden gefuseerd met het gen van elk RNA dat door een cel wordt geproduceerd. RhoBAST zelf is niet-fluorescerend, maar verlicht een celdoorlatende rhodamine-kleurstof door er op een zeer specifieke manier aan te binden. "Dit leidt tot een dramatische toename van de fluorescentie die wordt bereikt door het RhoBAST-kleurstofcomplex, wat een essentiële vereiste is voor het verkrijgen van uitstekende fluorescentiebeelden", legt dr. Murat Sunbul van de IPMB uit, en voegt eraan toe: "Voor RNA-beeldvorming met superresolutie heeft aanvullende eigenschappen nodig. "

De onderzoekers ontdekten dat elk rhodamine-kleurstofmolecuul slechts ongeveer een seconde aan RhoBAST gebonden blijft voordat het weer loskomt. Binnen enkele seconden herhaalt deze procedure zich met een nieuw kleurstofmolecuul. "Het is vrij zeldzaam om sterke interacties te vinden - zoals tussen RhoBAST en rhodamine - gecombineerd met uitzonderlijk snelle uitwisselingskinetiek", zegt prof. Dr. Gerd Ulrich Nienhaus van de APH. Aangezien rhodamine pas oplicht na binding aan RhoBAST, resulteert de constante reeks nieuwe interacties tussen marker en kleurstof in onophoudelijk "knipperen". “Dit 'aan-uit schakelen' is precies wat we nodig hebben voor SMLM-beeldvorming”, vervolgt prof. Nienhaus.

Tegelijkertijd lost het RhoBAST-systeem nog een ander belangrijk probleem op. Fluorescentiebeelden worden verzameld onder bestraling met laserlicht, die de kleurstofmoleculen na verloop van tijd vernietigt. De snelle kleurstofwisseling zorgt ervoor dat fotogebleekte kleurstoffen worden vervangen door nieuwe. Dit betekent dat individuele RNA-moleculen gedurende langere tijd kunnen worden waargenomen, wat de beeldresolutie aanzienlijk kan verbeteren, legt prof. Dr. Andres Jaeschke, een wetenschapper bij de IPMB, uit.

De onderzoekers uit Heidelberg en Karlsruhe waren in staat om de uitstekende eigenschappen van RhoBAST als RNA-marker aan te tonen door RNA-structuren in darmbacteriën (Escherichia coli) en gekweekte menselijke cellen te visualiseren met een uitstekende lokalisatieprecisie. “We kunnen details onthullen van voorheen onzichtbare subcellulaire structuren en moleculaire interacties met RNA met behulp van superresolutie fluorescentiemicroscopie. Dit zal een fundamenteel nieuw begrip van biologische processen mogelijk maken ”, zegt prof. Jaeschke.

###

Het onderzoek van Murat Sunbul en Andres Jaeschke in het kader van de studie werd ondersteund door de Duitse Onderzoeksstichting (DFG) en het werk van Gerd Ulrich Nienhaus werd ondersteund door de DFG en de Helmholtz Vereniging. De resultaten zijn in het tijdschrift gepubliceerd Nature Biotechnology.