DNAテンプレートからRNAを生成する酵素は、リソースが不足していて細菌Escherichia coliがその成長を遅らせる必要がある場合に、細胞内で最も豊富なタイプのRNAであるリボソームRNA（rRNA）の生成を遅らせるように変更されます。 研究者は、低温電子顕微鏡法（cryo-EM）を使用して、DNAと複合体を形成している間にRNAポリメラーゼの構造をキャプチャし、成長不良の条件に応じてその活性がどのように変化するかを示しました。 ペン州の科学者が主導した研究を説明する論文が22年2020月XNUMX日にジャーナルに掲載されました ネイチャー·コミュニケーションズ.

「RNAポリメラーゼは、DNAにコード化された情報を使用してさまざまなRNAを生成する酵素です」とペンシルバニア州立大学の生化学および分子生物学の教授で研究チームのリーダーである村上勝彦は述べています。 「これは、分子生物学のセントラルドグマにおける重要なステップのXNUMXつです。つまり、遺伝子情報をDNAからRNAに転送し、RNAがタンパク質をコードすることがよくあります。 それは生命に必要であり、その過程は基本的にバクテリアから人間まで共有されます。 RNAポリメラーゼの構造がその活性と機能を調節するためにどのように変化するかを理解することに興味がありますが、その構造を決定するためにサンプルを結晶化する必要があるX線結晶学のような従来の方法を使用してキャプチャすることは困難でした。

RNAポリメラーゼは、RNAにされる遺伝子の最初の近くにある「プロモーター」と呼ばれる特定のDNA配列に結合することによって機能します。 この相互作用中のポリメラーゼの構造と機能を理解するには、プロモーターDNAに結合している間にポリメラーゼを捕捉する必要がありますが、一部のプロモーターでは相互作用が非常に不安定になる可能性があります。 結晶学は、複合体が非常に安定している場合にのみプロモーターに結合したRNAポリメラーゼを捕捉できますが、リボソームRNAプロモーターの場合、この相互作用は不安定になる傾向があるため、ポリメラーゼはすぐに脱出してRNAの作成を開始できます。 これらの相互作用を確認するために、研究者たちは、溶液中の高分子の構造を視覚化できる方法であるクライオEMに目を向けました。

「RNAについて話すとき、ほとんどの人はタンパク質を作るためのテンプレートであるメッセンジャーRNA（mRNA）について考えます」と村上は言いました。 「しかし、細胞内で最も豊富なタイプのRNAは、実際にはタンパク質をコードしていません。 リボソームRNAはリボソームの主要な構造成分であり、メッセンジャーRNAをテンプレートとして使用してタンパク質を構築する細胞機構です。 リボソームRNA合成は、大腸菌細胞の全RNA合成の最大70％を占めています。」

大腸菌が栄養豊富な成長条件でXNUMX分ごとに行うことができる細胞が分裂するとき、それは機能するのに十分なリボソームをXNUMXつの結果として生じる娘細胞に提供する必要があるので、それは継続的にリボソームRNAを作ります。

「封筒裏の計算を行う場合、大腸菌細胞は70,000分ごとに約20個のリボソームを作成する必要があります」と村上氏は述べています。 「これは、RNAポリメラーゼが各リボソームRNAプロモーターから1.7秒ごとにリボソームRNA合成を開始することを意味します。 したがって、リボソームRNA合成ステップに迅速に移行するために、ポリメラーゼはリボソームRNAプロモーターに一時的に結合する必要があります。 これは結晶学的アプローチには理想的ではありませんが、クライオEM研究では、この相互作用を捉えることができ、実際、単一のサンプルで相互作用のさまざまな段階を確認できました。」

研究者らは、XNUMXつの異なる段階でRNAポリメラーゼ-プロモーター複合体の三次元構造を決定することができました。 XNUMXつはDNAがまだ「閉じている」とき、DNA分子のXNUMXつの鎖が分離されてテンプレート鎖にアクセスできるようになる前（これを閉じた複合体と呼びます）、もうXNUMXつはDNAが「開いている」とき（開いていると呼ばれます）複合体）そしてRNA合成を開始するために準備されます。

「ポリメラーゼの一部に、？と呼ばれる大きなコンフォメーション変化が見られました。 （シグマ）プロモーターDNAに結合するときの因子で、これまで観察されたことはありません」と村上氏は語った。 「この変更により、DNAがポリメラーゼの裂け目に入ることができるゲートが開き、開いた複合体がすばやく形成されます。」

リソースが限られているために大腸菌の増殖を遅らせる必要がある場合、DksAと呼ばれるグローバルな転写調節因子とppGppと呼ばれる細菌のシグナル伝達分子のXNUMXつの分子がポリメラーゼと直接結合して、リボソームRNAの生成を減らします。 研究チームは、これらXNUMXつの因子の結合がポリメラーゼのコンフォメーションをどのように変化させ、プロモーター特異的にその活性に影響を与えるかを調査しました。

「ポリメラーゼに結合するDksAとppGppはそのコンフォメーションを変化させ、ゲートが開くのを防ぎます。そのため、ポリメラーゼは別の経路をたどって開いた複合体を形成する必要があります」と村上氏は述べています。 「これはリボソームRNAプロモーターにとって理想的な経路ではないため、その活性が低下します。 直接的な機能的結果をもたらすポリメラーゼへのこれらのコンフォメーション変化を見るのはエキサイティングです。 クライオEMなしではこれを行うことができなかったので、ペンシルベニア州立大学でこのテクノロジーを利用して、クライオEM標本を準備するための実験条件を最適化してから、NCIの国立クライオEM施設に送ることができてとても感謝しています。 / NIHは高解像度のデータ収集用です。 以前はアクセスできなかった細胞成分や複合体の分析を継続できるようになります。」

###

村上に加えて、研究チームには、ペンシルベニア州立大学のYeonohShinとM.Zuhaib Qayyum、ロシア科学アカデミーのDanil Pupov、Daria Esyunina、AndreyKulbachinskiyが含まれています。 この研究は、米国国立衛生研究所、ロシア科学財団、およびロシア基礎研究財団によって資金提供されました。 追加のサポートは、国立癌研究所の国立癌研究所のフレデリック国立研究所にある国立クライオEM施設によって提供されました。