La scoperta, avvenuta durante il Progetto Genoma Umano nei primi anni 2000, che noi esseri umani abbiamo solo circa 20,000 geni codificanti proteine ​​– circa tanti quanti i minuscoli vermi nematodi che vivono nel suolo e meno della metà di quelli della pianta di riso – è stata uno shock. . Quel colpo al nostro orgoglio è stato però attenuato dall’idea che il genoma umano è ricco di connessioni regolatrici. I nostri geni interagiscono in una fitta rete, in cui pezzi di DNA e le molecole che codificano (RNA e proteine) controllano l’“espressione” di altri geni, influenzando se producono i rispettivi RNA e proteine. Per comprendere il genoma umano, dovevamo comprendere questo processo di regolazione genetica.

Questo compito, tuttavia, si sta rivelando molto più difficile che decodificare la sequenza del genoma.

Inizialmente, si sospettava che la regolazione genetica fosse una semplice questione di un prodotto genetico che fungeva da interruttore di accensione/spegnimento per un altro gene, in modo digitale. Negli anni '1960, i biologi francesi François Jacob e Jacques Monod fecero i primi chiarimenti un processo di regolazione genetica nel dettaglio meccanicistico: In Escherichia coli Nei batteri, quando una proteina repressore si lega a un certo segmento di DNA, blocca la trascrizione e la traduzione di una serie adiacente di geni che codificano per gli enzimi per la digestione dello zucchero lattosio. Questo circuito regolatore, che Monod e Jacob hanno soprannominato lago operone, ha una logica chiara e trasparente.

Ma la regolazione genetica nei metazoi complessi – animali come gli esseri umani, con cellule eucariotiche complesse – generalmente non sembra funzionare in questo modo. Si tratta invece di un gruppo di molecole, tra cui proteine, RNA e frammenti di DNA provenienti da tutto un cromosoma, che in qualche modo collaborano per controllare l'espressione di un gene.

Non si tratta solo del fatto che questo processo di regolazione negli eucarioti ha più attori di quanto si osservi tipicamente nei batteri e in altre cellule procariotiche semplici; sembra essere un processo categoricamente diverso e più confuso.

Un team dell'Università di Stanford, guidato dal biofisico e bioingegnere Polly Fordyce, sembra ora aver scoperto una componente di questa modalità confusa di regolazione genetica. Il loro lavoro, pubblicato lo scorso settembre in Scienze, suggerisce che il DNA vicino a un gene agisce come una sorta di pozzo poco profondo per intrappolare diverse molecole regolatrici, mantenendole pronte all'azione in modo che, quando necessario, possano aggiungere la loro voce alla decisione sull'attivazione o meno del gene.

Questi pozzetti regolatori sono costituiti da tratti di DNA decisamente strani. Sono costituiti da sequenze in cui un breve tratto di DNA, lungo da una a sei paia di basi, si ripete molte volte. Decine di copie di queste “brevi ripetizioni in tandem” (STR) possono essere messe insieme in queste sequenze, come la stessa piccola “parola” scritta ancora e ancora.

Gli STR sono abbondanti nel genoma umano: comprendono circa il 5% di tutto il nostro DNA. Un tempo si pensava che fossero classici esempi di DNA “spazzatura” perché un “testo” ripetitivo di DNA composto solo da STR non può contenere tante informazioni significative quanto, ad esempio, la sequenza irregolare di lettere che compongono una frase in questo articolo.

Eppure, gli STR non sono chiaramente insignificanti: sono stati collegati a malattie come la malattia di Huntington, l'atrofia muscolare spinobulbare, il morbo di Crohn e alcuni tumori. Negli ultimi due decenni si sono accumulate prove del fatto che possono in qualche modo migliorare o inibire la regolazione genetica. Il mistero era come potessero essere così potenti con così poco contenuto informativo.

Controlli complessi per cellule complesse

Per comprendere come gli STR si inseriscono nel quadro generale della regolazione genetica, facciamo un passo indietro. I geni sono abitualmente affiancati da pezzi di DNA che non codificano RNA o proteine ​​ma hanno funzioni regolatrici. I geni batterici hanno regioni “promotrici” in cui gli enzimi polimerasi possono legarsi per iniziare la trascrizione del DNA adiacente in RNA. Hanno anche abitualmente regioni “operatrici”, dove le proteine ​​repressore possono legarsi per bloccare la trascrizione, disattivando un gene, come nel lago operone.

Negli esseri umani e in altri eucarioti, le sequenze regolatrici possono essere più numerose, varie e sconcertanti. Le regioni chiamate potenziatori, ad esempio, influenzano la probabilità che un gene venga trascritto. Gli stimolatori sono spesso gli obiettivi di proteine ​​chiamate fattori di trascrizione, che possono legarsi per aumentare o inibire l’espressione genica. Stranamente, alcuni stimolatori si trovano a decine di migliaia di paia di basi di distanza dai geni che regolano, e vengono avvicinati ad essi solo attraverso la riorganizzazione fisica degli anelli di DNA in un cromosoma compatto.

La regolazione dei geni eucariotici coinvolge tipicamente questi numerosi e diversi blocchi regolatori del DNA, insieme a uno o più fattori di trascrizione e altre molecole, tutti riuniti attorno a un gene come un comitato convocato per decidere cosa dovrebbe fare. Si riuniscono in un ammasso sciolto e denso.

Spesso, inoltre, i partecipanti molecolari non sembrano interagire attraverso gli accoppiamenti altamente selettivi “serratura e chiave” comuni nella biologia molecolare. Sono invece molto meno esigenti, interagiscono in modo piuttosto debole e non selettivo, come se girovagassero e avviassero brevi conversazioni tra loro.

In effetti, il modo in cui i fattori di trascrizione si legano al DNA negli eucarioti è rimasto un mistero. Per molto tempo si è ritenuto che una parte di un fattore di trascrizione dovesse corrispondere strettamente a una sequenza “motivo” legante nel DNA, come i pezzi di un puzzle. Ma sebbene alcuni di questi motivi siano stati identificati, la loro presenza non sempre è correlata molto bene con il punto in cui gli scienziati trovano fattori di trascrizione attaccati al DNA nelle cellule. A volte i fattori di trascrizione persistono in regioni senza motivi, mentre alcuni motivi che sembrano dover legare fortemente i fattori di trascrizione rimangono vuoti.

"Tradizionalmente nella genomica, l'obiettivo è stato quello di classificare i siti genomici in modo [binario] come 'legati' o 'non legati'" in base ai fattori di trascrizione, ha affermato Fordyce. "Ma il quadro è molto più sfumato di così." I singoli membri di questi “comitati” di regolazione genetica non sembrano essere invariabilmente presenti o assenti alle loro riunioni, ma piuttosto hanno diverse probabilità di essere presenti o meno.

La tendenza della regolazione genetica negli eucarioti a fare affidamento su così tante e diverse interazioni deboli tra grandi complessi molecolari "è una delle cose che rende notoriamente difficile il controllo teorico", ha affermato il biofisico. Thomas Kuhlmann dell'Università della California, Riverside, che ha scritto un commento sul documento del laboratorio Fordyce per Scienze. È un profondo enigma il modo in cui, da questo processo apparentemente caotico, emergono decisioni precise sull'attivazione e disattivazione dei geni.

Al di là della misteriosa logica confusa di quel processo decisionale, c'è anche la questione di come tutti i membri del comitato trovino la strada per raggiungere la stanza giusta - e poi rimangano lì. Le molecole generalmente si muovono all'interno della cellula per diffusione, sballottate da tutte le altre molecole circostanti, come l'acqua, e vagando in direzioni casuali. Potremmo aspettarci che questi comitati sciolti si allontanino troppo rapidamente per svolgere il loro lavoro di regolamentazione.

Questo, secondo Fordyce e i suoi colleghi, è il punto in cui entrano in gioco gli STR. Gli STR sono sorprendentemente comuni nei siti potenziatori del DNA. Nel loro articolo, i ricercatori sostengono che gli STR agiscono come cerotti appiccicosi che riuniscono i fattori di trascrizione e impediscono loro di allontanarsi.

Ottimizzazione della viscosità

Il gruppo di Fordyce ha studiato sistematicamente come le differenze nella sequenza STR influenzano l'adesione dei fattori di trascrizione a un motivo di legame. Hanno esaminato due fattori – uno derivante dal lievito, l’altro dagli esseri umani – che si attaccano a un particolare motivo a sei basi. I ricercatori hanno misurato sia la forza (o affinità) di quel legame sia la velocità con cui i fattori di trascrizione si bloccano e si sbloccano (cinetica) quando il motivo è affiancato da una STR invece che da una sequenza casuale. Per fare un confronto, hanno esaminato la facilità con cui i fattori si legano al solo STR e a una sequenza di DNA del tutto casuale.

"Una delle maggiori sfide in questo campo è quella di districare la miriade di variabili che incidono sul legame del [fattore di trascrizione] in una posizione specifica del genoma", ha affermato David Suter, biologo molecolare presso l'Istituto Federale Svizzero di Tecnologia di Losanna in Svizzera. La forma del DNA, la vicinanza ad altri segmenti di DNA e la tensione fisica nelle molecole di DNA possono tutti svolgere un ruolo nel legame del fattore di trascrizione. I valori di questi parametri probabilmente differiscono in ogni posizione del genoma, e forse anche tra i tipi di cellule e all'interno di una singola cellula nel tempo in una data posizione. “Si tratta di un vasto spazio di variabili sconosciute che sono molto difficili da quantificare”, ha affermato Suter.

Ecco perché esperimenti ben controllati come quelli del team di Stanford sono così utili, ha aggiunto Kuhlman. Di solito, quando i ricercatori hanno bisogno di misurare interazioni deboli come queste, hanno due scelte: possono effettuare alcune misurazioni molto dettagliate ed estremamente precise e generalizzare da esse, oppure possono effettuare un gran numero di misurazioni veloci e sporche e utilizzare metodi matematicamente complessi. metodi statistici per dedurre i risultati. Ma Fordyce e i suoi colleghi, ha detto Kuhlman, hanno utilizzato una procedura automatizzata basata su chip microfluidici per effettuare misurazioni precise durante esperimenti ad alto rendimento “per ottenere il meglio da entrambi i mondi”.

Il team di Stanford ha scoperto che diverse sequenze STR possono alterare le affinità di legame dei fattori di trascrizione al DNA fino a un fattore di 70; a volte hanno un impatto maggiore sul legame del fattore di trascrizione rispetto alla modifica della sequenza del motivo di legame stesso. E gli effetti erano diversi per i due diversi fattori di trascrizione esaminati.

Quindi gli STR sembrano in grado di mettere a punto la capacità dei fattori di trascrizione di agganciarsi a un sito del DNA e quindi di regolare un gene. Ma come, esattamente?

Una sala d'attesa vicino a un gene

I ricercatori hanno pensato che la parte di un fattore di trascrizione che lega il DNA potrebbe interagire debolmente con un STR, con la forza esatta di tale affinità che dipende dalla sequenza STR. Poiché tale legame è debole, non avrà molta specificità. Ma se un fattore di trascrizione viene catturato e rilasciato ripetutamente da un STR, l'effetto cumulativo è di mantenere il fattore di trascrizione nelle vicinanze del gene in modo che sia più probabile che si leghi saldamente alla regione del motivo, se necessario.

Fordyce e i suoi colleghi hanno previsto che gli STR agiscono quindi come una “lobby” o un pozzo in cui i fattori di trascrizione possono riunirsi, anche se transitoriamente, vicino a un sito di legame regolatorio. "La natura ripetitiva di un STR amplifica l'effetto debole di ogni singolo sito di legame di cui è costituito", ha affermato Connor Horton, il primo autore dello studio, che ora è dottorando presso l'Università della California, Berkeley.

Al contrario, ha aggiunto, alcuni STR possono anche agire per allontanare i fattori di trascrizione dalle sequenze regolatrici, assorbendo fattori di trascrizione altrove come una spugna. In questo modo, possono inibire l’espressione genica.

Il lavoro, ha affermato Suter, “dimostra in modo convincente che gli STR hanno un impatto diretto sul legame dei fattori di trascrizione in vitro”. Inoltre, il team di Stanford ha utilizzato un algoritmo di apprendimento automatico per dimostrare che gli effetti osservati nei loro esperimenti in vitro sembrano verificarsi anche nelle cellule viventi (cioè in vivo).

Ma Roberto Tjian, biochimico di Berkeley e ricercatore presso l'Howard Hughes Medical Institute, ritiene che potrebbe essere troppo presto per essere sicuri dell'influenza che una determinata combinazione di fattori di trascrizione STR ha sull'espressione genetica nelle cellule reali.

Tjian, Saverio Darzacq e i loro colleghi del laboratorio che gestiscono insieme a Berkeley concordano sul fatto che gli STR sembrano offrire un modo per concentrare i fattori di trascrizione vicino ai siti di regolazione genetica. Tuttavia, senza sapere quanto devono essere vicini i fattori per attivare la trascrizione, è difficile comprendere il significato funzionale di tale risultato. Tjian ha detto che vorrebbe vedere se l'introduzione di un STR in una cellula vivente influenza in modo prevedibile l'espressione di un gene bersaglio. Al momento, ha affermato, “non è convinto che le STR costituiranno necessariamente un aspetto importante dei meccanismi [regolatori] in vivo”.

Una grammatica combinatoria

Un enigma persistente è come un tale meccanismo fornisca in modo affidabile il tipo di precisa regolazione genetica di cui le cellule hanno bisogno, poiché sia ​​la forza che la selettività del legame del fattore di trascrizione all'interno dei pozzetti STR sono deboli. Fordyce ritiene che tale specificità di influenza potrebbe derivare da molte fonti: non solo dalle differenze nelle sequenze STR ma anche dalle interazioni cooperative tra fattori di trascrizione e altre proteine ​​coinvolte nella regolazione.

Considerato tutto ciò, ha detto Horton, non è chiaro se sarà semplice prevedere l'effetto di una determinata combinazione di fattori di trascrizione STR sull'espressione di un gene. La logica del processo è davvero confusa. E la “grammatica” dell’influenza è probabilmente combinatoria, ha aggiunto Horton: il risultato dipende da diverse combinazioni di fattori di trascrizione e altre molecole.

Il team di Stanford ritiene che forse il 90% dei fattori di trascrizione siano sensibili agli STR, ma che nel genoma umano vi siano molti più tipi di fattori di trascrizione che tipi di STR. "La mutazione di una sequenza STR potrebbe influenzare il legame di 20 diversi fattori di trascrizione in quel tipo di cellula, portando a una diminuzione complessiva della trascrizione di quel gene vicino senza implicare alcun fattore di trascrizione specifico", ha detto Horton.

Quindi, in effetti, il team di Stanford concorda con Tjian sul fatto che la regolazione genetica nelle cellule viventi non sarà guidata da un unico e semplice meccanismo. Piuttosto, i fattori di trascrizione, i loro siti di legame sul DNA e altre molecole regolatrici possono riunirsi in gruppi densi che esercitano collettivamente la loro influenza.

"Ora ci sono numerosi esempi che supportano l'idea che gli elementi del DNA possano affollare i fattori di trascrizione al punto da formare condensati con cofattori", ha affermato Riccardo Giovani, un biologo cellulare del Whitehead Institute del Massachusetts Institute of Technology. Gli stimolatori legano molti fattori di trascrizione per produrre quell’affollamento. Gli STR possono essere un ingrediente che aiuta a radunare i fattori di trascrizione per raggrupparsi vicino a un gene, ma non saranno l'intera storia.

Perché regolare i geni in questo modo complicato, invece di fare affidamento sul tipo di interazioni forti e specifiche tra proteine ​​regolatrici e siti del DNA che dominano nei procarioti? È possibile che tale confusione sia ciò che ha reso possibile la nascita di metazoi complessi e di grandi dimensioni.

Per essere specie vitali, gli organismi devono essere in grado di evolversi e adattarsi alle mutevoli circostanze. Se le nostre cellule facessero affidamento su una rete enorme ma strettamente prescritta di interazioni genetiche regolatrici, sarebbe difficile apportare modifiche senza interrompere l’intero congegno, proprio come un orologio svizzero si bloccherà se rimuoviamo (o spostiamo anche leggermente) qualsiasi delle sue miriadi di ruote dentate. Se le interazioni molecolari regolatorie sono vaghe e piuttosto non specifiche, tuttavia, c’è un utile margine di flessibilità nel sistema, proprio come un comitato può generalmente prendere una buona decisione anche se uno dei suoi membri è malato.

Fordyce osserva che nei procarioti come i batteri può essere relativamente facile per i fattori di trascrizione trovare i loro siti di legame perché il genoma da cercare è più piccolo. Ma ciò diventa più difficile man mano che il genoma diventa più grande. Nei grandi genomi degli eucarioti, "non è più possibile tollerare il rischio di rimanere temporaneamente bloccati in un sito di legame 'sbagliato'", ha detto Fordyce, perché ciò comprometterebbe la capacità di rispondere rapidamente alle mutevoli condizioni ambientali.

Inoltre, gli STR stessi sono altamente evolutivi. Un allungamento o un accorciamento della loro sequenza, o un'alterazione della dimensione e della profondità del “pozzo del fattore di trascrizione”, possono verificarsi facilmente a causa di incidenti nella replicazione o riparazione del DNA, o attraverso la ricombinazione sessuale dei cromosomi. Per Fordyce, suggerisce che gli STR “potrebbero quindi servire come materia prima per l’evoluzione di nuovi elementi normativi e la messa a punto dei moduli normativi esistenti per programmi trascrizionali sensibili”, come quelli che governano lo sviluppo di animali e piante.

Il potere delle interazioni deboli

Tali considerazioni stanno portando i biologi molecolari a prestare molta più attenzione alle interazioni deboli e relativamente non selettive nel genoma. Molti di questi coinvolgono proteine ​​che, invece di avere una struttura fissa e precisa, sono sciolte e flosce – “intrinsecamente disordinate”, come dicono i biochimici. Se le proteine ​​funzionassero solo attraverso domini strutturali rigidi, ha spiegato Young, ciò limiterebbe non solo il modo in cui i sistemi di regolazione potrebbero evolversi, ma anche i tipi di regolazione dinamica osservati nella vita. "Non troverai un organismo vivente - e nemmeno un virus - funzionante solo con elementi strutturali stabili come quelli di un orologio svizzero", ha detto Young.

Forse l’evoluzione si è appena imbattuta negli STR come componente di una soluzione così complessa ma in definitiva più efficace per la regolazione genetica negli eucarioti. Gli STR stessi possono formarsi in diversi modi, ad esempio attraverso errori nella replicazione del DNA o attraverso l’attività di segmenti di DNA chiamati elementi trasponibili che creano copie di se stessi in tutto il genoma.

"È successo che le interazioni deboli emergenti risultanti tra le proteine ​​e le sequenze ripetitive fossero qualcosa che poteva... fornire un vantaggio selettivo alle cellule in cui si verificava", ha detto Kuhlman. La sua ipotesi è che questa confusione sia stata probabilmente imposta agli eucarioti, ma che "successivamente siano stati in grado di sfruttarla a proprio vantaggio". I batteri e altri procarioti possono fare affidamento su una logica normativa “digitale” ben definita perché le loro cellule tendono ad esistere solo in pochi stati semplici e distinti, come muoversi e replicarsi.

Ma i diversi stati cellulari dei metazoi sono “molto più complessi e talvolta vicini a un continuum”, ha detto Suter, quindi sono meglio serviti da una regolamentazione “analogica” più confusa.

"I sistemi di regolazione genetica nei batteri e negli eucarioti sembrano essere divergenti in modo sostanziale", concorda Tjian. Mentre si dice che Monod una volta abbia osservato che “ciò che è vero per E. coli è vero per l'elefante”, sembra che non sia sempre così.