Preparazione della coltura di neuroni primari

I protocolli sperimentali che prevedono il prelievo di tessuti animali sono stati approvati dall'ufficio veterinario del Canton Basilea Città secondo le leggi federali svizzere sulla protezione degli animali e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida approvate. I chip HD-MEA o i coprioggetto in vetro sono stati sterilizzati in etanolo al 70% per 60 minuti e lavati con acqua deionizzata sterile sotto flusso d'aria laminare. La serie di elettrodi o i vetrini coprioggetto sono stati quindi trattati con 10 µl di poli(etileneimina) allo 0.05% (v/v) (Sigma-Aldrich) in tampone borato (Thermo Fisher Scientific) per 40 minuti a temperatura ambiente e lavati con acqua deionizzata, seguiti mediante incubazione con 8 µl di 0.02 mg ml^-1 laminina (Sigma-Aldrich) in mezzo neurobasale (NB) (Gibco) per 30 minuti a 37 ° C. Embrioni di ratto Wistar E-18 sono stati sezionati in HBSS ghiacciato (Gibco) per raccogliere le loro cortecce, che sono state poi dissociate in trypsin-EDTA allo 0.25% (Gibco). Le cellule corticali dissociate sono state delicatamente triturate e filtrate attraverso un setaccio da 0.45 µm per ottenere singole cellule. È stata stimata la densità cellulare e 10 µl di 3,000 cellule µl^-1 la soluzione è stata placcata sulla serie di elettrodi. È stato consentito alle cellule di attaccarsi agli array incubando i chip a 37 °C per 40 minuti prima di aggiungere 2 ml di mezzo di placcatura NB. Il terreno di piastratura NB è stato preparato aggiungendo 50 ml di siero di cavallo (HyClone), 1.25 ml di glutamax (Invitrogen) e 10 ml di B-27 (Invitrogen) a 450 ml di Neurobasal (Gibco). I chip HD-MEA sono stati conservati all'interno di un incubatore per colture cellulari a 37 °C e al 5% di CO₂. Dopo 3 giorni, le cellule sono state coltivate in terreno di piastratura NB privo di siero fino a DIV 20 scambiando il 50% dei terreni di coltura con terreno di piastratura NB fresco una volta ogni 3 giorni. Tutti gli esperimenti, ad eccezione dei dati mostrati in Fig. 1i, sono stati condotti tra DIV 14 e 16 perché le cellule hanno mostrato proprietà meccaniche diverse durante la crescita¹¹. Gli esperimenti per i dati mostrati in Fig. 1i sono stati raccolti tra DIV 22 e 24, quando le reti neuronali mostravano un'attività di bursting sincrona.

Preparazione della fetta di cervelletto

Topi wild-type (giorno postnatale 14 C57BL/6Rj, Janvier Labs) sono stati decapitati sotto anestesia con isoflurano; i loro cervelli furono rimossi e immersi in acqua ghiacciata contenente bollicine di carbogeno (95% O₂ +5%CO₂) soluzione di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF). Fette cerebellari sagittali di ~350 µm sono stati ottenuti utilizzando un vibratomo (VT1200S, Leica). Tutte le fette sono state mantenute a temperatura ambiente in aCSF fino al momento dell'uso. L'aCSF era composto da 125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, glucosio 25 mM, NaH 1.25 mM₂PO₄ e NaHCO 25 mM₃. La serie di elettrodi dei chip HD-MEA è stata quindi trattata con 10 µl di poli(etileneimmina) allo 0.05% (v/v) (Sigma-Aldrich) in tampone borato (Thermo Fisher Scientific) per 40 minuti a temperatura ambiente e lavata con soluzione deionizzata acqua, seguita da un'incubazione con 8 µl di 0.02 mg ml^-1 laminina (Sigma-Aldrich) in mezzo neurobasale (Gibco) per 30 minuti a 37 ° C. La laminina in eccesso dopo l'incubazione è stata pipettata via e la matrice è stata lasciata asciugare. La fetta cerebellare è stata quindi posizionata delicatamente sulla serie di elettrodi utilizzando la punta della pipetta tagliata per evitare danni causati dalle forze di taglio durante il pipettaggio (Figura XNUMX supplementare). 13). Un'arpa su misura da 2 mm è stata posizionata sulla fetta di tessuto per immobilizzare la fetta di tessuto. Le fette di tessuto sono state quindi immerse in aCSF aggiungendo delicatamente goccia a goccia. La fetta di tessuto immobilizzato immersa in aCSF è stata quindi lasciata aderire alla serie di elettrodi per 30 minuti. Poco prima della registrazione, l'arpa è stata rimossa e la testa AFM è stata montata sul chip HD-MEA. Il tessuto è stato continuamente perfuso con aCSF con bollicine di carbogeno per mantenere la vitalità e l'attività cellulare.

Configurazione HD-MEA

Chip HD-MEA basati su semiconduttore a ossido di metallo complementare (CMOS) con 26,400 elettrodi (passo 17.5 µm) all'interno di un'area di rilevamento complessiva di 3.85 × 2.10 mm² erano abituati²⁵. I chip sono stati fabbricati in una fonderia commerciale e post-elaborati e confezionati internamente (Figura 2 supplementare). 1b). Sui chip sono stati incollati anelli di policarbonato trasparente (GB Plex) di 4 cm di diametro e i collegamenti dei fili sono stati incapsulati con resina epossidica scura biocompatibile (EPO-TEK 353 ND). Il rivestimento platino-nero degli elettrodi è stato elettrodepositato per ridurre l'impedenza dell'elettrodo e migliorare le caratteristiche segnale-rumore (Fig. 1c). Le versioni commerciali del nostro sistema HD-MEA sviluppato su misura possono essere acquistate (modello MaxOne) da MaxWell Biosystems.

Portacampioni e riscaldatore da palco

Un riscaldatore del campione termoelettrico basato su Peltier, con una sonda di temperatura per il feedback a circuito chiuso, è stato controllato da un controller di temperatura costruito in casa per mantenere il campione a 37 °C. Il riscaldatore del campione era allineato con il pad di conduzione termica sul chip HD-MEA. I chip sono stati quindi montati su un supporto per campioni e bloccati in posizione con il perno caricato a molla del supporto. Prusa I3 MK3S+ è stata utilizzata per stampare in 3D i frugali supporti per siringhe per l'impostazione della perfusione che erano fissati al supporto del campione. L'intero allestimento è stato montato su misura x,y stadio piezo tramite una piastra di base.

x,y stadio piezoelettrico

Due stadi piezo lineari (serie Xeryon XLS-1) con una risoluzione dell'encoder di 5 nm sono stati collegati l'uno all'altro perpendicolarmente (Fig. 1a). Le fasi lineari erano controllate da un controller multiasse Xeryon XD-M collegato a un'interfaccia utente basata su LabVIEW. L'elettrodo in alto a sinistra del chip HD-MEA è stato registrato come origine del sistema di coordinate e le coordinate dell'elettrodo con i neuroni di interesse sono state estratte dall'interfaccia utente di MaxWell Biosystems. Queste coordinate sono state quindi inviate al controller XD-M utilizzando script personalizzati per un facile posizionamento dei neuroni sotto il cantilever AFM.

Microscopia a fluorescenza a lunga distanza di lavoro

Un microscopio ottico (Nikon SMZ 25) con lenti zoom regolabili 15.75× e obiettivo 1× (Nikon, MNH55100 P2-SHR PlanApo 1X; apertura numerica, 0.156) è stato allineato con l'impostazione come menzionato nel testo principale. Un illuminatore a diodi emettitori di luce (LED) controllabile tramite TTL (CoolLED PE 300^ultra) è stato utilizzato come sorgente luminosa per l'imaging senza filtri di eccitazione/emissione. Per filtrare la luce di eccitazione riflessa dal chip HD-MEA è stato utilizzato un divisore di raggio a tripla banda passante (F66-412, AHF Analysentechnik). Una grande fotocamera con array CMOS (Nikon DS-QI2) con 4,908 × 3,264 pixel (dimensione dei pixel, 7.3 × 7.3 µm²) è stato montato sul microscopio utilizzando un obiettivo del proiettore montato su f 2.5× che consente il campionamento fino a 45 fps con un ingrandimento finale di ~40× e una risoluzione di 0.46 µm per pixel.

AFM

Una testa AFM (Catalyst, Bruker) è stata montata e allineata con il set-up come menzionato nel testo principale. Uno scanner piezoelettrico da 15 µm sulla testa è stato utilizzato per raccogliere tutte le curve forza-spostamento e forza-tempo, mentre un piezoelettrico da 150 µm è stato utilizzato per posizionare il cantilever sul neurone. I dati sono stati raccolti ed esportati in file .txt utilizzando il software AFM (Nanoscope v.9.2, Bruker). I dati sono stati analizzati e tracciati con script Python. Perle di silice con diametro di 5 μm (Kisker Biotech) sono state incollate all'estremità libera di microcantilever senza punta (CSC-37 o 38, Micromash HQ) utilizzando colla ultravioletta (Dymax) e sono state polimerizzate con ultravioletti per 20 minuti. I cantilever con perline sono stati puliti per 5 minuti utilizzando un pulitore al plasma (Harrick Plasma), quindi montati sul supporto della sonda del fluido con una finestra in zaffiro da 2 mm e calibrati utilizzando il metodo del rumore termico⁴⁸.

AFM correlativa, HD-MEA e microscopia ottica

L'AFM, l'HD-MEA e il microscopio ottico erano allineati come mostrato (Fig. 1a). La luce fluorescente proveniente dai neuroni sui chip HD-MEA è stata raccolta attraverso una finestra in zaffiro nel supporto a sbalzo AFM e passata al microscopio ottico. L'immagine di fluorescenza dei neuroni sul chip HD-MEA è stata raccolta sequenzialmente in regioni di interesse, cucita e registrata sull'interfaccia utente Maxwell MEA per localizzare i neuroni sul chip HD-MEA (Fig. 2a-d). Il x,y le coordinate dei neuroni di interesse sono state quindi fornite al file x,y stage tramite script LabVIEW, posizionando così il cantilever AFM nelle posizioni desiderate ~Precisione di 5 nm. L'intero set-up è stato installato su un tavolo isolato smorzante e collocato in una camera protetta dal rumore e a temperatura controllata per ridurre il rumore meccanico e la deriva termica.

Sincronizzazione TTL

Gli impulsi TTL del DS-Qi2 sono stati estratti utilizzando un connettore autocostruito con un pin a quattro poli da 3.5 pollici, una mini spina su un lato e un ponticello femmina da 24 AWG (RND 255-00015, Distrelec) sull'altro lato. Il pin 1 era la terra e il pin 4 (EXP_TMG) riceveva 2.4 V a livello HI (alto) durante il funzionamento in tensione in base al tempo di esposizione impostato. Un impulso negativo di 0–5 V è stato estratto dal canale di uscita 1 del pannello frontale del controller AFM (Bruker Nanoscope V) attraverso un connettore costruito in casa con un pin maschio BNC standard su un lato e un ponticello femmina 24 AWG (RND 255 -00015, Distrelec) dall'altro lato. I segnali, estratti sia dalla fotocamera che dall'AFM, sono stati quindi instradati ai pin 2 e 8 di un singolo accoppiatore ottico ad alta velocità. I segnali sono stati quindi inviati al sistema di acquisizione dati HD-MEA tramite un gate array programmabile sul campo, fornendo indicazioni temporali precise degli eventi rilevati dall'AFM e dalla microscopia ottica sulle registrazioni di file grezzi dei dati HD-MEA raccolti a 20 kHz.

Protocollo e misurazioni di monitoraggio della rigidità

Il modulo di Young apparente è stato calcolato da una media di cinque curve forza-spostamento raccolte sul soma neuronale. Abbiamo quindi aspettato 30 secondi per assicurarci che non vi fossero cambiamenti meccanici indotti dalla misurazione nei neuroni e abbiamo raccolto nuovamente cinque curve forza-spostamento (Fig. 2a), che abbiamo etichettato come un ciclo di misurazione e che è rappresentato da un punto (Fig. 2b). Abbiamo ripetuto questo ciclo di misurazione fino a 5 minuti su un neurone e siamo passati al neurone successivo nella rete. Sessanta minuti dopo la prima misurazione sul primo neurone, siamo tornati allo stesso neurone e il ciclo di misurazioni è stato ripetuto. Le misurazioni comprendevano un ciclo di monitoraggio su scala temporale lunga. Questo ciclo di tracciamento su lunga scala è stato ripetuto tre volte (Fig. 2c). Per le misurazioni della rigidità dei neuriti, abbiamo prima registrato l'attività elettrofisiologica dei neuroni per 5 minuti e poi identificato due neuriti ben isolati per neurone e raccolto su di essi le curve forza-spostamento. Le curve forza-spostamento sono state raccolte utilizzando microcantilever CSC-38 (costante elastica nominale, ~0.02 Nm^-1) con perline di 5 μm di diametro come menzionato sopra. Una forza massima di 700 pN sui somi e di 400 pN sui neuriti è stata utilizzata per raccogliere le curve forza-distanza (Fig. 14a, b). Per tutte le misurazioni, la velocità della punta è stata mantenuta costante a 10 µm/s^-1. Il punto di contatto è stato determinato dalla curva forza-spostamento di avvicinamento come x intercettare a un valore di forza cinque volte superiore alla deviazione standard del rumore di base, seguito da una cura manuale. La profondità di rientranza è stata calcolata come il valore di spostamento nel punto di contatto dopo aver sottratto la deflessione del cantilever e impostato il valore di spostamento alla forza massima su zero nella curva forza-spostamento (Fig. 14c). La profondità di indentazione per la stessa forza massima data varierebbe da soma a soma a seconda della sua rigidità. Pertanto, abbiamo impostato un limite di profondità di indentazione di 750 nm. Nelle curve forza-spostamento, tutti i valori di forza per i quali il valore di spostamento corrispondente superava il limite della profondità di indentazione sono stati scartati. Il modulo di Young apparente è stato calcolato da tali curve a cui il modello di Hertz per un penetratore sferico con un semispazio elastico⁴⁹ è stato montato utilizzando codici personalizzati in Python.

I valori del modulo di Young misurati nel nostro studio per il soma dei neuroni rientrano in un intervallo comparabile con i rapporti precedenti^10,11. Tuttavia, il modulo di Young dei neuriti è inferiore ai valori riportati, pur essendo ancora su un ordine di grandezza comparabile. Questo bias potrebbe derivare dalla nostra scelta di misurare i due neuriti basali più spessi del neurone, che sono tipicamente più morbidi. Per misurare la rigidità dei somi neuronali durante burst e IBI, abbiamo raccolto curve forza-spostamento ad una frequenza di 5 Hz. Questo processo è stato ripetuto più volte per ciascun soma ed è stata calcolata la rigidità media del soma durante i periodi di scoppio e durante gli IBI. Mentre le esplosioni di solito appaiono secondo uno schema ritmico (Fig. 2h), è difficile prevedere per i neuroni in coltura quando un singolo neurone va incontro a bursting. Per raccogliere almeno due curve forza-spostamento durante i periodi di scoppio o IBI, riducendo al minimo il numero di volte in cui la sonda entra in contatto con il neurone, abbiamo rientrato il neurone 5 volte s^-1.

Protocollo di compressione statica

Una sfera di 5 µm di diametro, incollata a un microcantilever AFM senza punta (CSC-37; costante elastica nominale, ~0.8 Nm^-1), era posizionato sopra il soma. La pallina è stata abbassata sul soma fino al raggiungimento della forza di setpoint richiesta per applicare 0.1 kPa o 5 kPa e mantenuta in contatto per 60 s utilizzando un feedback ad altezza costante prima di ritrarre la pallina (Fig. 5b). La curva forza-tempo registrata alla frequenza di campionamento di 500 kHz mostra sia lo spostamento verticale della testa AFM che la risposta della forza del soma. L'altezza media del soma dei neuroni corticali del ratto era ~8 µm (Figura complementare. 11a).

Imaging funzionale del calcio

I sensori del calcio geneticamente codificati sono stati espressi nei neuroni utilizzando virus adeno-associati (AAV). AAV1-EF1a-GCaMP6 (1.8 × 10¹³ genomi virali ml^-1) sono stati utilizzati con una molteplicità di infezioni di 5.0 × 10⁴ per esprimere GCaMP6. I neuroni sono stati infettati al DIV 3; l'espressione veniva solitamente osservata a DIV 5–9.

Analisi funzionale dell'imaging del calcio di neuroni stimolati meccanicamente

Una curva di intensità di fluorescenza media ΔI/I della curva GCaMP6s è stata calcolata come il segnale medio sull'intera immagine rispetto alla linea di base dell'immagine. Il rilevamento del picco nel segnale è stato eseguito individuando i massimi locali entro una finestra di 3 s. Un evento è stato contrassegnato come l'inizio di una risposta neuronale quando l'ampiezza del segnale del calcio raggiungeva il 10% del valore di picco. Dati da 2.5 s prima e 10 s dopo l'inizio del picco di risposta (t = 0) è stato tracciato.

Registrazioni HD-MEA

Per registrare i dati è stata utilizzata l'interfaccia utente MaxWell Biosystem (MaxLab Live v.22.13). L'immagine di fluorescenza dell'intero chip è stata registrata sull'interfaccia utente (Fig. 2c). I neuroni di interesse sono stati identificati dai picchi di calcio e l'attività dei picchi (potenziali d'azione) è stata ottenuta dai grafici raster in tempo reale sull'interfaccia utente. Una volta identificato un neurone di interesse, 512 elettrodi attorno a questo neurone in una configurazione rettangolare sono stati indirizzati alla lettura. Dopo aver posizionato il cantilever AFM sul neurone, i canali sono stati sfalsati cinque volte per compensare il rumore del laser infrarosso utilizzato dall'AFM per rilevare la deflessione del cantilever prima di iniziare la registrazione. Per tutte le registrazioni sono stati utilizzati un guadagno di 512 e un filtro passa-alto con cut-off a 300 Hz. Per migliorare le prestazioni degli algoritmi di ordinamento dei picchi in Fig. 5, i potenziali d'azione neuronali sono stati registrati 2.5 minuti prima e dopo la stimolazione meccanica.

Analisi dei dati HD-MEA

Tutti i dati HD-MEA raccolti sono stati elaborati tramite script personalizzati basati sull'interfaccia Spike⁵⁰. In breve, le registrazioni extracellulari sono state filtrate e ordinate tramite Kilosort2, seguite dalla cura manuale di tutte le registrazioni. Per la cura sono state utilizzate una soglia conservativa di violazione dell'intervallo tra picchi pari a 0.5 e una soglia del rapporto segnale/rumore pari a 5.0. Per la valutazione della qualità dell'unità sono stati utilizzati la somiglianza del modello, gli autocorrelogrammi e i correlogrammi incrociati. Le caratteristiche della forma d'onda come la mezza larghezza e la pendenza di ripolarizzazione sono state estratte per le unità ordinate in picchi per le rispettive epoche con script Python utilizzando le funzioni di Spikeinterface (Fig. 12a-i). I cambiamenti relativi nelle caratteristiche della forma d'onda su tutti gli elettrodi all'interno dell'impronta extracellulare di un neurone sono stati ottenuti dividendo il valore della caratteristica della forma d'onda media di tutti i picchi durante la compressione meccanica per la caratteristica della forma d'onda media di tutti i picchi prima della compressione. La frequenza di attivazione media e l'intervallo tra picchi sono stati calcolati dai treni di picchi estratti utilizzando il toolkit di analisi elettrofisiologica Elephant 0.11.2⁵¹. I tassi di attivazione medi per i dati di correlazione della rigidità sono stati calcolati posizionando i picchi in intervalli di 30 s in modo che corrispondessero ai punti temporali dei valori di rigidità. I tassi di attivazione medi per il protocollo di compressione sono stati calcolati posizionando i picchi in tre contenitori prima, durante e dopo la compressione.

Microscopia combinata AFM e confocale

L'imaging confocale time-lapse è stato eseguito su un microscopio confocale a scansione laser invertito (Observer Z1, LSM 700; Zeiss) dotato di un obiettivo ad immersione in acqua LCI PlanApo 25×/0.8 (Zeiss). Un AFM (CellHesion 200; JPK Instruments) è stato montato sul microscopio confocale. I protocolli di compressione meccanica sono stati eseguiti utilizzando il software JPK CellHesion. Per la stimolazione meccanica, l'AFM è stato utilizzato per avvicinare il cantilever con la perlina sulla cellula a velocità di 0.1, 1, 10 o 100 μm/s^-1 fino al raggiungimento della forza nominale e, successivamente, immediatamente retratto alla stessa velocità utilizzata per l'avvicinamento. Per gli esperimenti che determinano la forza di soglia per stimolare meccanicamente i neuroni, la forza di setpoint applicata è stata aumentata gradualmente da 50 a 400 nN con incrementi di 50 nN e intervalli di 20 s (Fig. 6). La forza di setpoint della perlina in avvicinamento è stata aumentata gradualmente fino a quando non è stata registrata una risposta neuronale. Dopo aver stimolato con successo il neurone, il cantilever è stato retratto e un nuovo neurone è stato selezionato per la stimolazione.

analisi statistica

Tutti i dati che mostrano le proprietà della forma d'onda sono stati testati per verificarne la normalità con il test Shapiro-Wilk e Q-Q trame. Tutti i gruppi di dati non erano distribuiti normalmente ed erano gruppi di dati dipendenti. Pertanto, abbiamo utilizzato il test dei ranghi con segno di Wilcoxon. L'ipotesi nulla era che non vi fosse alcuna differenza nelle mediane tra le distribuzioni confrontate a coppie. P valori >0.05 sono stati considerati non significativi. Le caratteristiche della forma d'onda sono state estratte dalla forma d'onda media di ciascun neurone ottenuto da n > 5,000 picchi. Tutti i dati che mostrano i tassi medi di accensione sono stati confrontati con il test dei ranghi con segno di Wilcoxon n > 10,000 picchi. I gruppi di dati AFM sono stati confrontati utilizzando il metodo Mann-Whitney a due code U-Test. P i valori per ciascun confronto sono menzionati nelle legende delle figure. La correlazione di Pearson è stata utilizzata per determinare le correlazioni lineari nei valori di rigidità e velocità di accensione media. Non sono stati utilizzati metodi statistici per predeterminare le dimensioni del campione. La raccolta e l'analisi dei dati non sono state eseguite in modo cieco rispetto alle condizioni degli esperimenti.

Reporting summary

Ulteriori informazioni sulla progettazione della ricerca sono disponibili nel Riepilogo dei rapporti sul portafoglio naturalistico collegato a questo articolo.

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• Fonte: https://www.nature.com/articles/s41565-024-01609-1