पशु अध्ययन

सभी चूहे C57BL/6J पृष्ठभूमि पर कोलंबिया विश्वविद्यालय पशु सुविधा में 23 ± 1 °C और 12 घंटे प्रकाश और अंधेरे चक्र के साथ बनाए रखा गया था। बिना तैयारी के चाउ फूड (पिकोलैब रोडेंट 5053) और पानी तक पहुंच। 60% वसा वाले एचएफडी को रिसर्च डाइट्स (डी12492आई) से खरीदा गया था। मोटापे की रोकथाम के अध्ययन के लिए, पुरुष या महिला चूहों को संकेतित समय के लिए दो बार साप्ताहिक रूप से फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में पी-जी3 (10 मिलीग्राम प्रति किलोग्राम शरीर के वजन) के साथ एचएफडी और आईपी इंजेक्ट किया गया। दुबले चूहों के उपचार में, छह सप्ताह के नर चूहों को चाउ आहार खिलाया गया और छह सप्ताह के लिए सप्ताह में दो बार पी-जी3 के साथ इंजेक्शन लगाया गया। मोटापे के इलाज के अध्ययन के लिए, पुरुष चूहों को एचएफडी खिलाने के दस सप्ताह के बाद मोटापे के लिए प्रेरित किया गया और फिर आईपी को एनपी (शरीर के वजन के 10 मिलीग्राम प्रति किलोग्राम) के साथ तीन बार साप्ताहिक रूप से छह सप्ताह के लिए इंजेक्ट किया गया। शरीर के वजन की साप्ताहिक निगरानी की गई, और शरीर की संरचना इकोएमआरआई द्वारा निर्धारित की गई। 16 घंटे के उपवास के बाद 4 घंटे फिर से खिलाने के बाद, सीओ द्वारा चूहों को मार दिया गया₂ ऊतक और प्लाज्मा संग्रह के लिए इच्छामृत्यु। प्लाज्मा इंसुलिन (इंसुलिन एलिसा, मर्कोडिया), टीजी (थर्मो साइंटिफिक) और एनईएफए (फुजीफिल्म वाको) को तदनुसार मापा गया। लिपिड अवशोषण को मापने के लिए, लिपिड को मल के नमूनों से निकाला गया था, जैसा कि पहले में वर्णित है³⁸, और मुक्त फैटी एसिड सामग्री (NEFA, Fujifilm Wako) निर्धारित की गई थी। कोलंबिया यूनिवर्सिटी एनिमल केयर एंड यूटिलाइजेशन कमेटी ने सभी जानवरों के अध्ययन को मंजूरी दी।

मेटाबोलिक फेनोटाइपिंग

अप्रत्यक्ष कैलोरीमेट्रिक अध्ययन के लिए, एचएफडी फीडिंग की शुरुआत के बाद से तीन पी-जी3 इंजेक्शन के बाद पुरुष चूहों के एक अलग समूह को व्यापक प्रयोगशाला पशु निगरानी प्रणाली (कोलंबस इंस्ट्रूमेंट्स) के अधीन किया गया था। ग्लूकोज टॉलरेंस टेस्ट (जीटीटी) के लिए, चूहों को 16 घंटे के लिए एक साफ बिस्तर के पिंजरे में उपवास किया गया और फिर ग्लूकोज (2 ग्राम प्रति किलोग्राम शरीर के वजन) के साथ इंजेक्शन लगाया गया। संकेतित समय बिंदुओं पर ब्रीज़ 2 ग्लूकोमीटर (बायर) का उपयोग करके रक्त शर्करा को मापा गया। इंसुलिन टॉलरेंस टेस्ट (ITT) के लिए, चूहों को 4 घंटे के लिए उपवास किया गया और इंसुलिन के साथ इंजेक्शन लगाया गया (0.75 U प्रति किलोग्राम शरीर का वजन)। लिपिड सहिष्णुता परीक्षण के लिए, चूहों को 4 घंटे के लिए उपवास किया गया और फिर एक मौखिक गैवेज द्वारा जैतून का तेल (200 μl प्रति चूहों) दिया गया। संकेतित समय बिंदुओं पर रक्त के नमूने टेल वेन ब्लीडिंग द्वारा लिए गए थे। तत्पश्चात, सीरम लिपिड सामग्री को तदनुसार मापा गया। लिपोलिसिस के लिए, चूहों को आइसोप्रोटेरेनॉल (शरीर के वजन के 10 मिलीग्राम प्रति किलोग्राम) के साथ इंजेक्ट किया गया था और रक्त को पूंछ की नस से रक्तस्राव के माध्यम से एकत्र किया गया था, और सीरम NEFA (Fujifilm Wako) और ग्लिसरॉल (सिग्मा, F6428) के स्तर को तदनुसार मापा गया था।

वसा-ऊतक ईसीएम अलगाव

संशोधनों के साथ पहले वर्णित पद्धति के बाद वाट को विकोशिकीय किया गया था³⁹. संक्षेप में, ऊतक को 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखा गया था जिसमें 0.02 मिनट के लिए 0.05 डिग्री सेल्सियस पर कक्षीय झटकों के साथ 37% ट्रिप्सिन-30% एथिलीनडायमिनेटेट्राएसिटिक एसिड घोल था, फिर एक और 30 मिनट पाचन के लिए एक नए ट्रिप्सिन-एथिलीनडामिनेटेट्राएसिटिक एसिड समाधान के साथ ऊष्मायन किया गया। इसके बाद, ऊतक को क्रमिक रूप से हिलाने के साथ कमरे के तापमान (आरटी) पर निम्नलिखित समाधानों में डाला गया: 3 घंटे के लिए 100% ट्राइटन एक्स -1, 4 घंटे के लिए 1% डीऑक्सीकोलिक एसिड समाधान, और 4% इथेनॉल और 0.1 के लिए 2% पेरासिटिक एसिड। एच। आसुत विआयनीकृत पानी (ddH₂ओ) समाधान परिवर्तन के बीच। ऊतक को 7.4 मिनट के लिए तीन बार पीबीएस (पीएच 15) में आरटी पर धोया गया, फिर डीडीएच में₂ओ 15 मिनट के लिए तीन बार और 100% में n-प्रोपेनोल 30 मिनट के लिए दो बार। अंत में, ऊतक को ddH से चार बार धोया गया₂ओ उपयोग करने के लिए तैयार होने से पहले 1 घंटे के लिए।

Cy5-लेबल P-G3 इमेजिंग

पूर्व विवो ऊतक वितरण इमेजिंग: चाउ आहार से संभावित ट्रेस पृष्ठभूमि संकेत को खत्म करने के लिए चूहों को एचएफडी के साथ पांच दिनों के लिए खिलाया गया था और फिर ऊतकों को एकत्र किया गया था। IWAT और eWAT के ऊतकों और ECM को 5 ° C पर झटकों के साथ 3 मिनट के लिए Cy100-लेबल वाले P-G30 (45 मिली में 37 μg) के साथ या बिना पीबीएस में डाला गया था। बाद में, ऊतकों को चार बार पीबीएस से धोया गया और फिर पर्किनएल्मर आईवीआईएस स्पेक्ट्रम ऑप्टिकल इमेजिंग सिस्टम (लिविंग इमेज 4.5.5 सॉफ्टवेयर) का उपयोग करके इमेजिंग विश्लेषण के अधीन किया गया।

विवो ऊतक वितरण इमेजिंग में: चाउ-फेड या एचएफडी-फेड चूहों को आईपी या अंतःशिरा मार्गों के माध्यम से या स्थानीय रूप से iWAT में Cy5- लेबल वाले पॉलिमर या NPs (200 μg प्रति चूहों) के साथ इंजेक्ट किया गया था। दिए गए समय बिंदुओं पर, पर्किनएल्मर आईवीआईएस सिस्टम (लिविंग इमेज 4.5.5 सॉफ्टवेयर) का उपयोग करके चूहों को विवो इमेजिंग के अधीन किया गया था। चूहों को तब मार दिया गया था, और उसी प्रणाली का उपयोग करके ऊतक संकेतों को मापा गया था।

सेल कल्चर और एडिपोसाइट भेदभाव

3T3-L1 (ATCC CL-173) और C3H10T1/2 (CCL-226) कोशिकाओं को ATCC से खरीदा गया था और उच्च ग्लूकोज Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम में 10% बछड़ा सीरम (मिथुन जैव-उत्पाद 100-506) या भ्रूण के साथ पूरक किया गया था। गोजातीय सीरम (गर्मी निष्क्रिय; कॉर्निंग 35-011-सीवी) और 1 × पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (थर्मो फिशर)। दो दिनों तक संगम पर पहुंचने के बाद कोशिकाओं को मानक एडिपोजेनिक कॉकटेल में विभेदित किया गया। कॉकटेल में डल्बेको का संशोधित ईगल माध्यम, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1 μM डेक्सामेथासोन, 10 μg ml शामिल हैं^{- 1} इंसुलिन और 0.5 मिमी 3-आइसोबुटिल-1-मिथाइलक्सैन्थिन। इसके अलावा, C5H3T10/1 कोशिकाओं के विभेदीकरण को सुविधाजनक बनाने के लिए पहले दो दिनों में 2 μM rosiglitazone का उपयोग किया गया था। दो दिनों तक शामिल करने के बाद, कोशिकाओं को 2.5 μg ml युक्त पूर्ण माध्यम में बनाए रखा गया था^{- 1} पूरी तरह से विभेदित होने तक इंसुलिन। पी-जी 3 पॉलिमर या एनपी (10 माइक्रोग्राम एमएल^{- 1}) संकेतित समय पर जोड़े गए थे, और कोशिकाओं को विश्लेषण के लिए भेदभाव के दौरान काटा गया था। लिपिड बूंदों को ऑइल रेड ओ स्टेनिंग या बॉडी स्टेनिंग का उपयोग करके देखा गया था। 3T3-L1 कोशिकाओं का इलाज 100 दिन से 4 दिन तक रैपामाइसिन (6 एनएम) के साथ किया गया था। C3H10T1/2 कोशिकाओं का लंबे समय तक रैपामाइसिन फ़ंक्शन विश्लेषण के लिए 100 से दिन 4 तक रैपामाइसिन (9 एनएम) के साथ इलाज किया गया था। 3T3-L1 कोशिकाओं को भेदभाव के 20 से दिन 0 के दौरान एनएमएन (3 मिमी) के साथ इलाज किया गया और विश्लेषण के लिए 4 दिन पर काटा गया।

पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल बाद मानव पेरीडिपोसाइट्स को सुसंस्कृत और विभेदित किया गया था⁴⁰. कोशिकाओं को पूर्ण विभेदन माध्यम में P-G3 के साथ या उसके बिना विभेदित किया गया था (10 माइक्रोग्राम मिली^{- 1}) दिन 0 से दिन 7 तक, और फिर दिन 3 से पी-जी7 के साथ या उसके बिना एक रखरखाव माध्यम में स्विच किया गया। कोशिकाओं को आगे जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए भेदभाव के दिन 7 या दिन 9 में काटा गया।

ह्यूमन फैट एक्सप्लांट ट्रीटमेंट

मानव वसा बायोप्सी एकत्र करने के लिए प्रोटोकॉल की समीक्षा की गई है और वेल कॉर्नेल मेडिसिन इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (19-05020126) द्वारा अनुमोदित किया गया है। ताजा मानव omental वसा ऊतक छोटे टुकड़ों (लगभग 10 मिलीग्राम) में कीमा बनाया हुआ था, आरटी पीबीएस के साथ धोया गया और मध्यम 199 में सुसंस्कृत 50 माइक्रोग्राम एमएल के साथ पूरक किया गया।^{- 1} जेंटामाइसिन, 7 एनएम इंसुलिन और 25 एनएम डेक्सामेथासोन⁴¹, एक ही समय में 10 माइक्रोग्राम एमएल के साथ या बिना इलाज किया जाता है^{- 1} पी-G3। माध्यम को हर तीन दिनों में बदल दिया गया था और आरएनए विश्लेषण के लिए उपचार के 8 दिन ऊतकों को काटा गया था।

ऑयल रेड ओ स्टेनिंग

विभेदित एडिपोसाइट्स को पीबीएस के साथ दो बार धोया गया और फिर 4 मिनट के लिए 30% फॉर्मेलिन-बफर समाधान में तय किया गया। इसके बाद, निश्चित कोशिकाओं को दो बार पानी से धोया गया, इसके बाद 60 मिनट के लिए 5% आइसोप्रोपानोल के साथ कवर किया गया और फिर 60 मिनट के लिए 15% ऑयल रेड ओ आइसोप्रोपेनॉल घोल को छानकर दाग दिया गया। कोशिकाओं को तब आसुत जल से धोया गया और उनकी छवि बनाई गई।

प्रारंभिक एंडोसोम धुंधला हो जाना

C3H10T1/2 कोशिकाओं को छह-वेल प्लेट (कॉर्निंग, 22 मिमी × 22 मिमी, नंबर 1) में कवर ग्लास पर चढ़ाया गया था और ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके विभेदित किया गया था। एक प्रारंभिक एंडोसोम मार्कर (सेललाइट अर्ली एंडोसोम्स-जीएफपी, बेकमैम 2.0, थर्मो फिशर साइंटिफिक; प्रत्येक कुएं में 12 μl) को रात भर शुरुआती एंडोसोम्स को दागने के लिए सेल माध्यम में जोड़ा गया था। पीबीएस के साथ धोने के बाद, Cy5- लेबल वाले P-G3 या Cy5- लेबल वाले NPs को संस्कृति माध्यम में 100 माइक्रोग्राम मिलीलीटर की अंतिम सांद्रता के साथ जोड़ा गया।^{- 1}. 15 मिनट या 1 घंटे के ऊष्मायन के बाद, Cy5-लेबल वाले P-G3 या Cy5-लेबल वाले एनपी को हटा दिया गया, और फिर कोशिकाओं को पीबीएस के साथ धोया गया और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया गया। नाभिक को डीएपीआई (4 ′, 6-डायमिडीनो-2-फेनिलइंडोल) के साथ दाग दिया गया था। छवियों को Nikon A1 कन्फोकल माइक्रोस्कोप पर लिया गया था।

सेलुलर ऑर्गेनेल धुंधला हो जाना

परिपक्व 3T3-L1 कोशिकाओं को चार-वेल लैब-टेक II चैम्बर वाले कवर ग्लास (थर्मो फिशर साइंटिफिक) में चढ़ाया गया था। Cy5- लेबल वाले P-G3 को 10 μg ml अंतिम सांद्रता के साथ संस्कृति माध्यम में जोड़ा गया था^{- 1}. 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को 50 मिनट के लिए क्रमशः लाइसोसोम या माइटोकॉन्ड्रिया को दागने के लिए 99 nM LysoTracker Red DND-100 (थर्मो फिशर साइंटिफिक) या 30 nM MitoTracker Red CMXRos (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी) वाले नए माध्यम से बदल दिया गया। एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम स्टेनिंग के लिए, कोशिकाओं को कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ हैंक के संतुलित नमक के घोल से धोया गया था, और 1 μM ईआर-ट्रैकर रेड डाई (थर्मो फिशर साइंटिफिक) को जीवित कोशिकाओं में न्यूक्लियस स्टेनिंग के लिए Hoechst 33243 के साथ जोड़ा गया था। लिपिड बूंदों के धुंधला होने के लिए, कोशिकाओं को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया था, पीबीएस के साथ धोया गया और फिर 1 मिनट के लिए 493 माइक्रोन बॉडीपी 503/5 (थर्मो फिशर साइंटिफिक) में तीन बार पीबीएस से धोने के बाद इनक्यूबेट किया गया। छवियों को ज़ीस एक्सियो ऑब्जर्वर 7 उपकरण पर लिया गया था।

कार्बोक्सिलेट माइक्रोबीड्स पर P-G3 कोटिंग

अतिरिक्त पी-जी 3 पॉलिमर को कार्बोक्जिलेट माइक्रोबिड्स (पॉलीबीड कार्बोक्सिलेट माइक्रोसेफर्स 6.00 माइक्रोन, पॉलीसाइंसेस) में एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ा गया, संक्षेप में भंवर और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर मिलाते हुए ऊष्मायन किया गया। माइक्रोबिड्स को सेल-कल्चर-ग्रेड पानी से धोया गया और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 × पर घुमाया गयाg 5 मिनट के लिए। तीन बार धोने के बाद, अवक्षेपित माइक्रोबीड्स को मूल मात्रा के सेल-कल्चर-ग्रेड पानी में फिर से जोड़ा गया, और सतह की क्षमता को मालवर्न ज़ेटासाइज़र नैनो ZS90 से मापा गया। माइक्रोबिड्स पर P-G3 सामग्री की मात्रा निर्धारित करने के लिए, ऊपर की प्रक्रिया का पालन करते हुए Cy5-लेबल वाले P-G3 का उपयोग किया गया था। P-G3 राशि मानक वक्र के अनुसार निर्धारित की गई थी। 3T3-L1 कोशिकाओं को 12-वेल ट्रांसवेल प्लेट (कॉर्निंग) में विभेदित किया गया था। फिर, 10 माइक्रोग्राम एमएल^{- 1} P-G3 या P-G3 की समान मात्रा वाले माइक्रोबीड्स को सीधे माध्यम में जोड़ा गया। ट्रांसवेल समूह में, माइक्रोबिड्स को 0.4 माइक्रोन ताकना आकार के सम्मिलित करके कोशिकाओं से अलग किया गया था।

एनपी संश्लेषण और लक्षण वर्णन

यहाँ 15 मिली मेथनॉल (थर्मो फिशर साइंटिफिक) में 3 μmol P-G5 (सिग्मा-एल्ड्रिच) को 75 मिली डाइक्लोरोमेथेन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) में 5 μmol कोलेस्ट्रॉल क्लोरोफॉर्मेट (सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ मिलाया गया, इसके बाद 300 μmol मिलाया गया। N,N-डायसोप्रोपाइलथाइलामाइन (सिग्मा-एल्ड्रिच)। मिश्रण को 50 घंटे के लिए 3 ° C पर हिलाया गया, और P-G72-Chol (3) उत्पन्न करने के लिए 5 घंटे के लिए अल्ट्राप्योर पानी में डायल किया गया। P-G3-Chol (5) NPs बनाने के लिए, 1 mg P-G3-Chol (5) को 200 μ l क्लोरोफॉर्म (थर्मो फिशर साइंटिफिक) में घोल दिया गया, इसके बाद 1 ml H मिलाया गया₂हे और sonication 2 मिनट के लिए। अंत में, 5 मिली एच₂O मिश्रण में जोड़ा गया था, और P-G3-Chol (5) NPs उत्पन्न करने के लिए एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग करके अतिरिक्त विलायक को हटा दिया गया था। परिणामी एनपी की संरचना को ब्रूकर एवांस III 400 एनएमआर उपकरण द्वारा चित्रित किया गया था। आकृति विज्ञान को टाइटन थेमिस 200 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया गया था। एनपी के हाइड्रोडायनामिक व्यास और जीटा क्षमता को मालवर्न नैनो जेडएस90 ज़ेटासाइज़र द्वारा मापा गया था। अवशोषण को डेनोविक्स डीएस-11+ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके मापा गया था।

NAD⁺ सेलुलर एकाग्रता

Preadipocytes या adipocytes का इलाज P-G3 (10 μg ml^{- 1}) या पीबीएस 14 घंटे के लिए, और सेलुलर एनएडी⁺/एनएडीएच स्तर एनएडी द्वारा निर्धारित किए गए थे⁺/NADH क्वांटिटेशन वर्णमिति किट (बायोविजन K337) निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए।

जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण

MACHEREY-NAGEL से RNA आइसोलेशन किट के संयोजन में TRIzol अभिकर्मक (थर्मो फिशर) का उपयोग करके ऊतकों या कोशिकाओं से कुल RNA निकाला गया। यहाँ 1 μg RNA का उपयोग उच्च क्षमता वाले cDNA रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) का उपयोग करके सीडीएनए को संश्लेषित करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए किया गया था। बायो-रेड CFX96 रियल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (PCR) सिस्टम का उपयोग GoTaq qPCR मास्टर मिक्स (Promega) के साथ मात्रात्मक रीयल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) करने के लिए किया गया था। सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति की गणना ΔΔCt विधि का उपयोग करके की गई थी साइक्लोफिलिन ए or आरपीएल23 संदर्भ जीन के रूप में। प्राइमरी सीक्वेंस सप्लीमेंट्री टेबल्स में उपलब्ध हैं 4 और 5.

scRNA-seq

जैसा कि ऊपर वर्णित है 3T3-L1 कोशिकाओं को सुसंस्कृत और विभेदित किया गया था। P-G3 (10 माइक्रोग्राम मिली^{- 1}) या पीबीएस को भेदभाव के 0 दिन से कोशिकाओं में जोड़ा गया था। कोशिकाओं को क्रमशः 0, 3 और 6 में पेरीडिपोसाइट्स, प्रारंभिक एडिपोजेनेसिस और परिपक्व एडिपोसाइट्स के रूप में एकत्र किया गया था (पूरक तालिका) 1). संग्रह में, कोशिकाओं को ट्रिप्सिन एंजाइमेटिक पाचन के साथ एकल कोशिकाओं में धीरे-धीरे अलग कर दिया गया था। 85x जीनोमिक्स क्रोमियम तकनीक का उपयोग करके scRNA-seq के अधीन करने से पहले ट्रिपैन ब्लू अपवर्जन द्वारा सेल व्यवहार्यता 10% से अधिक की पुष्टि की गई थी। परिणामी सिंगल-सेल 3'-एंड cDNA लाइब्रेरी को कोलंबिया जीनोम सेंटर के सिंगल सेल एनालिसिस कोर में इल्लुमिना नोवासेक 6000 सीक्वेंसिंग सिस्टम (2 × 100 बीपी पेयर-एंड) पर अनुक्रमित किया गया। यहां 10x जीनोमिक्स की सेल रेंजर पाइपलाइन (v. 3.1.0) माउस रेफरेंस ट्रांसक्रिप्टोम GRCm38 के साथ डेटा को प्रोसेस करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। पूरक तालिका में scRNA-seq के लिए नमूना जानकारी का विवरण सूचीबद्ध है 2. परिपक्व एडिपोसाइट्स (LQ004 और LQ005) वाले नमूनों में, सेल सस्पेंशन मीडिया में लिपिड ड्रॉपलेट्स भी होते हैं। लिपिड बूंदों को संयोग से बारकोड भी किया गया था। यह LQ004 और LQ005 में कम माध्य पढ़ने वाले सीक्वेंसर से उच्च अपेक्षित संख्या का कारण था। हमने अनुप्रवाह विश्लेषण के लिए केवल जीन संख्या (2,500 से 9,000 जीन) और माइटोकॉन्ड्रिया जीन प्रतिशत 20% से कम के साथ कोशिकाओं को रखते हुए अनुक्रमण डेटा में लिपिड ड्रॉपलेट शोर को बाहर रखा। सॉफ्टवेयर और एल्गोरिदम का विवरण पूरक तालिका में पाया जा सकता है 3.

आरएनए वेग और नियामक नेटवर्क विश्लेषण

पायथन (v. 1.7.1) में स्कैपी (v. 3.6) के साथ सामान्यीकरण और अनुपयोगी क्लस्टरिंग के लिए एकल-कोशिका विश्लेषण का प्रीप्रोसेसिंग किया गया था। हमने ज्ञात एडिपोजेनेसिस और लिपोजेनेसिस मार्करों के आधार पर सेल प्रकारों की व्याख्या की। जब लिपिड संचय जीन की एक उच्च अभिव्यक्ति देखी गई तो हमने परिपक्व एडिपोसाइट्स के उपसमूह को लिपोजेनिक एडिपोसाइट्स के रूप में वर्गीकृत किया। कुल मिलाकर, हमारे डेटासेट में चार प्रकार की कोशिकाएँ देखी गईं: पेरीडिपोसाइट्स, अपरिपक्व एडिपोसाइट्स, एडिपोसाइट्स और लिपोजेनिक एडिपोसाइट्स (चित्र। 4b, विस्तारित डेटा अंजीर। 5a और पूरक तालिका 1). इसके बाद, हमने scVelo (v. 0.2.1) और velocyto (v. 0.17.16) (अंजीर। 4e-एच और विस्तारित डेटा चित्र। 5डी, ई). विनियामक नेटवर्क की पहचान SCENIC (v. 1.2.2) (विस्तारित डेटा छवि XNUMX) द्वारा ट्रांसक्रिप्शन फ़ैक्टर के सह-अभिव्यक्ति पैटर्न और इसके डाउनस्ट्रीम इफ़ेक्टर जीन द्वारा की गई थी। 5c). आरएनए वेग और रेगुलेशन को पुनर्प्राप्त करने के तरीके डेटा सामान्यीकरण के प्रति असंवेदनशील हैं। हमने उपरोक्त विश्लेषण करने के लिए इनपुट के रूप में कच्चे अनुक्रमण डेटा और सेल-प्रकार एनोटेशन का उपयोग किया।

परिवर्तित जीन मार्ग विश्लेषण

हमने सांख्यिकीय महत्व (चित्र XNUMX) की गणना करने के लिए QIAGEN IPA सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया। 4i). संक्षेप में, IPA सॉफ़्टवेयर ने संदर्भ डेटाबेस (अर्थात, कैनोनिकल पाथवे में अणुओं के सेट) के साथ हमारे डेटासेट के ओवरलैप की गणना करने के लिए फिशर के सटीक परीक्षण का उपयोग किया। p मूल्य हमारे प्रायोगिक डेटासेट और यादृच्छिक अवसर के कारण एक विशिष्ट विहित मार्ग के बीच एक देखे गए जुड़ाव की संभावना को मापता है। संबंधित मार्ग प्रयोग डेटासेट के साथ महत्वपूर्ण रूप से जुड़ा हुआ है जब p मान छोटा है (अर्थात, p <0.05)।

लाइसोसोमल इंट्रासेल्युलर गतिविधि विश्लेषण

बायोविज़न लाइसोसोमल इंट्रासेल्युलर गतिविधि परख किट (k448-50) का उपयोग करके लाइसोसोमल गतिविधि निर्धारित की गई थी। संक्षेप में, C3H10T1/2 कोशिकाओं को विभेदन दिवस 3 से दिन 5 तक P-G7 के साथ या उसके बिना दर्शाया गया था। Bafilomycin A1 का उपयोग लाइसोसोम अवरोधक नियंत्रण के रूप में किया गया था। कोशिकाओं को तब 0.5% भ्रूण गोजातीय सीरम और 2 घंटे के लिए स्व-बुझती सब्सट्रेट के साथ पूरक एक सेल माध्यम में ऊष्मायन किया गया था, इसके बाद प्रयोग को समाप्त करने के लिए एक परख बफर के अलावा। कोशिकाओं को तब अलग कर दिया गया था और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण (488 एनएम उत्तेजना लेजर) के अधीन किया गया था। गेटिंग रणनीति को विस्तारित डेटा चित्र में दिखाया गया है। 6e. FCS Express (v. 7.14.0020) सॉफ़्टवेयर द्वारा फ़्लो साइटोमेट्री डेटा का विश्लेषण किया गया था।

पश्चिमी सोख्ता

कोशिकाओं या ऊतकों को प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल के साथ पूरक कुल प्रोटीन लसीका बफर के साथ lysed किया गया था। प्रोटीन सतह पर तैरनेवाला पियर्स बीसीए किट और 10% जेल सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन पृथक्करण का उपयोग करके प्रोटीन मात्रा का ठहराव के अधीन थे। इस अध्ययन में प्रयुक्त एंटीबॉडी इस प्रकार हैं: p-mTOR (CST #2971), p-S6K (CST #9205), p-4E-BP1 (CST #2855), p-AKT (धारा 473, CST #9271), p-AKT (T308, CST #13038), p-GSK3b (Ser 9, CST #9322), FASN (CST #3180), ADIPSIN (R&D Systems, #AF5430), Adiponectin (थर्मो फिशर, #PA1-054), सीईबीपीए (सांता क्रूज़, एससी-61), एचएसपी90 (प्रोटीनटेक, #13171-1-एपी) और जीएपीडीएच (प्रोटीनटेक #एचआरपी-60004)। एंटीबॉडी का कमजोर पड़ना निर्माता की वेबसाइट पर सिफारिश पर आधारित था।

हिस्टोलॉजिकल आकलन

विच्छेदन के बाद, eWAT, iWAT और लीवर को तुरंत 10% फॉर्मेलिन-बफर समाधान में तय किया गया। निर्धारण और निर्जलीकरण के बाद, ऊतकों को पैराफिन में एम्बेड किया गया था, F4 / 80 (CST, # 70076), हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन (H & E) या आवधिक एसिड-शिफ के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था, और एक माइक्रोस्कोप (ओलंपस IX71) के तहत फोटो खींचा गया था। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए, eWAT, iWAT और लीवर को तुरंत 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर तय किया गया, और फिर आरटी पर रातोंरात 30% सुक्रोज में निर्जलित किया गया और इसके बाद एक इष्टतम कटिंग तापमान माध्यम (सकुरा टिशू-टेक ओसीटी कंपाउंड 4583) में एम्बेड किया गया। 5 सुक्ष्ममापी स्लाइड्स में बढ़ने के बाद, जमे हुए वर्गों को एंटीबॉडी केवोलिन-1 (D46G3) (CST, #3267; 1:250 कमजोर पड़ने) और फिर एंटी-खरगोश एलेक्सा 488 एंटीबॉडी (थर्मो फिशर साइंटिफिक, #A27034; 1:1,000) के साथ जोड़ा गया कमजोर पड़ना), और आगे मुखर माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया गया। छवियों को ImageJ सॉफ़्टवेयर (v. 2.1.0; राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान) का उपयोग करके संसाधित किया गया था।

सांख्यिकीय विश्लेषण

दो-पूंछ वाले छात्र का उपयोग करके समूहों के बीच महत्व का मूल्यांकन किया गया था t-परीक्षण। समूहों के बीच अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण है यदि p मान 0.05 से कम है। इस अध्ययन में, सभी डेटा को माध्य (सेम) की औसत ± मानक त्रुटि के रूप में दर्शाया गया है। विश्लेषण के लिए प्रिज्म 9.3.1 (ग्राफपैड) का इस्तेमाल किया गया।

रिपोर्टिंग सारांश

अनुसंधान डिजाइन के बारे में अधिक जानकारी में उपलब्ध है प्रकृति पोर्टफोलियो रिपोर्टिंग सारांश इस लेख से जुड़ा।

• एसईओ संचालित सामग्री और पीआर वितरण। आज ही प्रवर्धित हो जाओ।
• प्लेटोब्लॉकचैन। Web3 मेटावर्स इंटेलिजेंस। ज्ञान प्रवर्धित। यहां पहुंचें।
• स्रोत: https://www.nature.com/articles/s41565-022-01249-3