डाइकारबॉक्सिलिक एसिड ट्रांसपोर्टर की अभिव्यक्ति और उपोत्पाद मार्गों का विलोपन

आरटीसीए मार्ग का पिछला परिचय मैं. ओरिएंटलिस (तनाव एसए) (चित्र। 1B) शेक फ्लास्क किण्वन में 11.6 ग्राम/लीटर के अनुमापांक के साथ एसए का उत्पादन सक्षम किया गया¹³. टिटर को और बेहतर बनाने के लिए, हमने SA के लिए एक ट्रांसपोर्टर को व्यक्त करने का प्रयास किया। MAE1 से स्किज़ोसैक्रोमाइसेस पोम्बे (SpMAE1) एसए के निर्यात के लिए सबसे कुशल डाइकारबॉक्सिलिक एसिड ट्रांसपोर्टर पाया गया¹⁸. कोडन-अनुकूलित SpMAE1 स्ट्रेन SA के जीनोम में एकीकृत किया गया, जिसके परिणामस्वरूप स्ट्रेन SA/MAE1 प्राप्त हुआ। ऑक्सीजन-सीमित परिस्थितियों में 1 ग्राम/लीटर ग्लूकोज के साथ न्यूनतम मीडिया (एससी-यूआरए) में शेक फ्लास्क किण्वन का उपयोग करके एसए उत्पादन के लिए उपभेदों एसए और एसए/एमएई50 का मूल्यांकन किया गया था। की शुरूआत SpMAE1 एसए टिटर को 6.8 ग्राम/लीटर से बढ़ाकर 24.1 ग्राम/लीटर कर दिया गया (चित्र)। 2, पूरक छवि। 1A, और अनुपूरक चित्र। 1B).

त्रुटि पट्टियाँ, माध्य ± SD (n  = 3 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने)। *p <0.05, **p  < 0.01, ***p  <0.001, एनएस महत्वपूर्ण नहीं, दो-पूंछ वाले अयुग्मित द्वारा गणना की गई t-परीक्षण। स्रोत डेटा को स्रोत डेटा फ़ाइल के रूप में प्रदान किया जाता है।

पूर्ण आकार की छवि

इथेनॉल प्रमुख उपोत्पाद था और SA/MAE9.5 स्ट्रेन के किण्वन में 1 ग्राम/लीटर पर जमा हुआ था। इथेनॉल अल्कोहल डिहाइड्रोजनेज (एडीएच) द्वारा उत्प्रेरित प्रतिक्रिया से बनता है, जो एसीटैल्डिहाइड को इथेनॉल में कम करने के लिए एनएडीएच का उपयोग करता है। चूंकि आरटीसीए मार्ग द्वारा एसए के उत्पादन के लिए एनएडीएच की आवश्यकता होती है, इथेनॉल निर्माण मार्ग को समाप्त करने से एसए उत्पादन में सुधार हो सकता है। इसके अलावा, हालांकि ग्लिसरॉल 1 ग्राम/लीटर से कम जमा होता है और स्ट्रेन SA/MAE1 के किण्वन में देखा जाने वाला प्रमुख उपोत्पाद नहीं था, ग्लिसरॉल-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GPD) द्वारा उत्प्रेरित ग्लिसरॉल गठन मार्ग संभावित रूप से आरटीसीए मार्ग के साथ प्रतिस्पर्धा कर सकता है। कार्बन और NADH. इस प्रकार, दोनों PDC (पाइरूवेट डिकार्बोक्सिलेज़) और GPD स्ट्रेन SA/MAE1 में हटा दिए गए, जिसके परिणामस्वरूप स्ट्रेन SA/MAE1/pdc∆/gpd∆ प्राप्त हुआ। को हटाते समय PDC इथेनॉल गठन को रोकने के लिए सैद्धांतिक रूप से पाइरूवेट और एनएडीएच दोनों की उपलब्धता में वृद्धि के कारण एसए टिटर में सुधार करना चाहिए, स्ट्रेन SA/MAE1/pdc∆/gpd∆ के किण्वन के परिणामस्वरूप अप्रत्याशित रूप से 24.6 ग्राम/एल के समान एसए टिटर और 19.8 का संचय हुआ। ऑक्सीजन-सीमित परिस्थितियों में पाइरूवेट का जी/एल (चित्र)। 2 और अनुपूरक चित्र। 1C).

हाल ही में, एक जीनोम-स्केल मॉडल का निर्माण किया गया था मैं. ओरिएंटलिस, और सभी एडीएच गतिविधियों को माइटोकॉन्ड्रियन में स्थानीयकृत होने की भविष्यवाणी की गई थी¹⁹. इस प्रकार, इथेनॉल उत्पादन को हटाने के माध्यम से PDC विलोपन से साइटोसोलिक एनएडीएच उपलब्धता में वृद्धि नहीं होनी चाहिए, जिससे एसए टिटर में कोई वृद्धि नहीं होगी। साइटोसोलिक एनएडीएच संतुलन के संबंध में, ग्लाइकोलाइसिस 2 मोल ग्लूकोज से 2 मोल पाइरूवेट और 1 मोल एनएडीएच का उत्पादन करता है, जबकि 1 मोल पाइरूवेट को 1 मोल स्यूसिनिक एसिड में बदलने के लिए 2 मोल एनएडीएच की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, हालांकि रिडक्टिव टीसीए चक्र में उच्चतम सैद्धांतिक उपज होती है, यीस्ट में एसए की वास्तविक उपज केवल 1 मोल/मोल ग्लूकोज तक सीमित होती है। हमने किया था ¹³सी मेटाबोलिक फ्लक्स विश्लेषण (एमएफए) और सत्यापित किया गया कि आरटीसीए मार्ग ने एसए उत्पादन के लिए ग्लाइकोलाइसिस द्वारा उत्पादित अधिकांश साइटोसोलिक एनएडीएच का कुशलतापूर्वक उपयोग किया है और पाइरूवेट उत्सर्जन ग्लाइकोलाइसिस के अंतिम चरण से उत्पादित पाइरूवेट के आधे हिस्से के लिए जिम्मेदार है (पूरक चित्र)। 2). हमने पाइरूवेट और एसए के बीच कार्बन प्रवाह को और अधिक व्यवस्थित करने के लिए स्ट्रेन SA/MAE1/pdc∆/gpd∆ में आरटीसीए पाथवे या पाथवे के व्यक्तिगत जीन की एक अतिरिक्त प्रतिलिपि भी व्यक्त की, लेकिन एसए टिटर या पाइरूवेट संचय में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हुआ। (पूरक चित्र। 3). इस प्रकार, साइटोसोल में एनएडीएच आपूर्ति की कमी आरटीसीए मार्ग के माध्यम से एसए उत्पादन के लिए मुख्य बाधा है।

एसए उत्पादन के लिए ग्लूकोज और ग्लिसरॉल का सह-किण्वन

चूंकि ग्लूकोज अकेले एसए उत्पादन के लिए पर्याप्त साइटोसोलिक एनएडीएच का उत्पादन नहीं करता है, इसलिए उच्च टाइटर्स और पैदावार प्राप्त करने के लिए अन्य कार्बन स्रोतों पर विचार किया जा सकता है। ग्लिसरॉल में उच्च स्तर की कमी होती है और इस प्रकार ग्लूकोज की तुलना में एनएडीएच के अधिक कम करने वाले समकक्ष उत्पन्न हो सकते हैं^20,21. चूंकि तनाव SA/MAE1/pdc∆/gpd∆ ने SC-URA माध्यम में ग्लिसरॉल के साथ एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में विकास दोष प्रदर्शित किया, इसलिए हमने 50 ग्राम/लीटर ग्लूकोज और 20 ग्राम के साथ SC-URA माध्यम का उपयोग करके इस तनाव का किण्वन करने की कोशिश की। /ग्लिसरॉल का एल. इससे पहले, ग्लूकोज और ग्लिसरॉल को दोहरे कार्बन स्रोतों के रूप में उपयोग करने से एक इंजीनियर में ग्लिसरॉल से एनएडीएच की बढ़ी हुई आपूर्ति के माध्यम से ऑक्सालोसेटेट के मैलेट में रूपांतरण को बढ़ाने में मदद मिली थी। एम. succiniciproducens⁶. जैसा कि पूरक चित्र में दिखाया गया है। 4A, कोशिकाएं ऑक्सीजन-सीमित परिस्थितियों में एसए उत्पादन के लिए दोनों सब्सट्रेट्स का उपभोग कर सकती हैं; हालाँकि, ग्लिसरॉल की खपत धीमी थी, और एसए टिटर किण्वन के 30.5 दिनों के बाद केवल 7 ग्राम/लीटर तक सुधरा था। फिर हमने एरोबिक परिस्थितियों में किण्वन किया, यह अनुमान लगाते हुए कि ग्लिसरॉल चयापचय ऑक्सीजन-सीमित स्थितियों में सीमित हो सकता है। एरोबिक परिस्थितियों में, ग्लूकोज और ग्लिसरॉल दोनों का तेजी से उपभोग किया गया, जिससे 38.6 ग्राम/लीटर एसए का उत्पादन संभव हुआ (चित्र)। 2 और अनुपूरक चित्र। 4B). हमने एरोबिक परिस्थितियों में 1 ग्राम/लीटर ग्लूकोज के साथ SC-URA माध्यम का उपयोग करके SA/MAE50/pdc∆/gpd∆ स्ट्रेन के किण्वन का भी परीक्षण किया। दिलचस्प बात यह है कि जबकि आरटीसीए मार्ग एक किण्वक मार्ग है और उच्च वातन एरोबिक श्वसन के लिए टीसीए चक्र में अधिक कार्बन प्रवाह को प्रवाहित कर सकता है, हमने देखा कि एरोबिक स्थितियों के कारण ऑक्सीजन-सीमित स्थितियों की तुलना में समान टाइटर्स होते हैं और कोशिकाएं ग्लूकोज का उपभोग करने में सक्षम होती हैं तेजी से, उच्च उत्पादकता के लिए अग्रणी (पूरक चित्र)। 4C).

डाइकारबॉक्सिलिक एसिड आयातक और बाहरी एनएडीएच डिहाइड्रोजनेज का विलोपन

इसके बाद एसए उत्पादन को बढ़ाने के लिए जीन विलोपन का प्रयास किया गया। हाल ही में, JEN परिवार के कार्बोक्सिलेट ट्रांसपोर्टर PkJEN2-1 और PkJEN2-2 पिचिया कुदरियावेज़वी डाइकार्बोक्सिलिक एसिड के अंतर्ग्रहण में शामिल होने की विशेषता थी^22,23. PkJEN2-1 और PkJEN2-2 को g3473 और g3068 के रूप में एनोटेट किया गया था मैं. ओरिएंटलिस, क्रमश। g3473 को स्ट्रेन SA/MAE1/pdc∆/gpd∆ से हटा दिया गया, जिससे स्ट्रेन g3473∆ उत्पन्न हुआ। एससी-यूआरए माध्यम में 50 ग्राम/लीटर ग्लूकोज और 20 ग्राम/लीटर ग्लिसरॉल के साथ इस स्ट्रेन के किण्वन से एसए टिटर में 42.0 ग्राम/लीटर तक सुधार हुआ (चित्र)। 2 और अनुपूरक चित्र। 5A), यह सुझाव देते हुए कि SA को कोशिकाओं में दोबारा प्रवेश करने से रोकना फायदेमंद था। g3068 को तनाव g3473∆ में और अधिक नष्ट कर दिया गया; हालाँकि, हमने देखा कि दोनों JEN2 ट्रांसपोर्टरों के विघटन ने SA टिटर को 34.5 g/L तक कम कर दिया और इस प्रकार यह लाभकारी नहीं था (पूरक चित्र)। 5B). यह परिणाम पिछली रिपोर्ट से असंगत था जिसमें दोनों जेईएन ट्रांसपोर्टरों को हटा दिया गया था पी. कुद्रियावज़ेवी CY902 के परिणामस्वरूप एकल जीन विलोपन की तुलना में उच्च एसए अनुमापांक प्राप्त हुआ, जिसका श्रेय विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि को दिया जा सकता है। पी. कुद्रियावज़ेवी CY902 को सक्सिनेट डिहाइड्रोजनेज कॉम्प्लेक्स सबयूनिट जीन को हटाकर ऑक्सीडेटिव टीसीए (ओटीसीए) मार्ग का उपयोग करके एसए का उत्पादन करने के लिए इंजीनियर किया गया था। एसडीएच१२९४, जबकि हमारे इंजीनियर में एसए उत्पादन मैं. ओरिएंटलिस एसडी108 को आरटीसीए मार्ग का उपयोग करके हासिल किया गया था। इसके अलावा, एमएफए के आधार पर, साइटोसोलिक एनएडीएच की एक छोटी मात्रा को बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल एनएडीएच डिहाइड्रोजनेज (एनडीई) द्वारा ऑक्सीकरण किया गया था, जो साइटोसोलिक एनएडीएच से माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (पूरक छवि) में इलेक्ट्रॉनों को स्थानांतरित करता है। 2). एनडीई तनाव g3473∆ में व्यवधान के लिए लक्षित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप तनाव g3473∆/nde∆ उत्पन्न हुआ। तनाव g3473∆ की तुलना में, एनडीई विलोपन ने एसए अनुमापांक को 46.4 ग्राम/लीटर तक सुधार दिया, जो नॉकआउट का संकेत देता है एनडीई एसए (छवि) के उत्पादन के लिए साइटोसोलिक एनएडीएच पूल में वृद्धि हुई। 2 और अनुपूरक चित्र। 5C). फिर भी, का व्यवधान एनडीई ग्लूकोज की खपत दर कम हो गई; इसलिए, उच्च अनुमापांक होने के बावजूद, स्ट्रेन g3473∆/nde∆ की उत्पादकता स्ट्रेन g3473∆ के समान थी (चित्र)। 2).

ग्लिसरॉल की खपत में सुधार

धीमी ग्लिसरॉल खपत ने संकेत दिया कि अंतर्जात ग्लिसरॉल चयापचय अत्यधिक सक्रिय नहीं हो सकता है। पहले, ग्लिसरॉल डिहाइड्रोजनेज की अधिक अभिव्यक्ति (जीडीएच) से पिचिया अन्गुस्ता और अंतर्जात डाइहाइड्रॉक्सीएसीटोन किनेज़ (डाक) ने एनएडीएच-उत्पादक ग्लिसरॉल खपत मार्ग की स्थापना की एस। अनुमस्तिष्क²⁴. इस प्रकार, हमने ग्लिसरॉल की खपत में सुधार के लिए एक समान रणनीति अपनाने की कोशिश की मैं. ओरिएंटलिस. कोडन अनुकूलित पीएजीडीएच और अंतर्जात डाक उपभेदों g3473∆ और g3473∆/nde∆ में अतिअभिव्यक्त किया गया, जिसके परिणामस्वरूप क्रमशः g3473∆/PaGDH-DAK और g3473∆/nde∆/PaGDH-DAK उपभेद बने। एससी-यूआरए माध्यम में 50 ग्राम/लीटर ग्लूकोज और 20 ग्राम/लीटर ग्लिसरॉल के साथ इन उपभेदों के किण्वन से एसए के उच्च अनुमापांक नहीं मिले; g3473∆/PaGDH-DAK और g3473∆/nde∆/PaGDH-DAK ने क्रमशः 41.9 g/L और 46.5 g/L के अनुमापांक पर SA का उत्पादन किया, जो कि अतिअभिव्यक्ति की कमी वाले मूल उपभेदों द्वारा प्राप्त अनुमापांक के समान है। पीएजीडीएच और डाक (अंजीर। 2, पूरक छवि। 6A, और अनुपूरक चित्र। 6B). हालाँकि, की अतिअभिव्यक्ति पीएजीडीएच और डाक ग्लूकोज और ग्लिसरॉल उपयोग दर दोनों के लिए फायदेमंद था। तनाव g0.29∆/PaGDH-DAK में उत्पादकता 0.44 से 3473 g/L/h और तनाव g0.28∆/nde∆/PaGDH-DAK में 0.32 से 3473 g/L/h तक बढ़ गई थी (चित्र)। 2 और अनुपूरक चित्र। 6C).

स्ट्रेन g3473∆/PaGDH-DAK 25.4 ग्राम/लीटर ग्लूकोज का उपयोग करके किण्वन में 50 ग्राम/लीटर SA का उत्पादन कर सकता है, जबकि 41.9 ग्राम/लीटर ग्लूकोज और 50 ग्राम/लीटर ग्लिसरॉल से 20 ग्राम/लीटर SA प्राप्त किया जा सकता है (पूरक) अंजीर। 7A). चूंकि 41.9 ग्राम/लीटर का एसए अनुमापांक केवल ग्लूकोज का उपयोग करके किण्वन में अधिक प्रारंभिक ग्लूकोज का उपयोग करके भी प्राप्त किया जा सकता है, कोई भी दोहरे कार्बन स्रोतों के रूप में ग्लूकोज और ग्लिसरॉल का उपयोग करने के फायदों पर सवाल उठा सकता है। कार्बन समतुल्य आधार पर, 1 ग्राम ग्लूकोज 1 ग्राम ग्लिसरॉल के बराबर है। 50 ग्राम/लीटर ग्लूकोज और 20 ग्राम/लीटर ग्लिसरॉल के उपयोग से 0.60 ग्राम/ग्राम ग्लूकोज के बराबर एसए उपज प्राप्त हुई, जो कि केवल 0.51 ग्राम/लीटर ग्लूकोज (पूरक चित्र) का उपयोग करके किण्वन से 50 ग्राम/ग्राम ग्लूकोज की उपज से अधिक थी। . 7B). इसके अलावा, 70 ग्राम/लीटर ग्लूकोज से, 50 ग्राम/लीटर ग्लूकोज और 20 ग्राम/लीटर ग्लिसरॉल के बराबर सांद्रता, स्ट्रेन g3473∆/PaGDH-DAK केवल 35.6 ग्राम/लीटर के अनुमापांक और 0.50 की उपज पर SA का उत्पादन कर सकता है। जी/जी ग्लूकोज (पूरक चित्र)। 7). इसलिए, कार्बन स्रोतों के रूप में ग्लूकोज और ग्लिसरॉल के मिश्रण का उपयोग करने से ग्लूकोज की समतुल्य मात्रा का उपयोग करने की तुलना में उच्च टिटर और उच्च पैदावार पर एसए उत्पादन की अनुमति मिलती है। हमने 3473 ग्राम/लीटर ग्लूकोज और 50 ग्राम/लीटर, 10 ग्राम/लीटर और 20 ग्राम/लीटर (पूरक चित्र) के विभिन्न ग्लिसरॉल सांद्रता का उपयोग करके तनाव g30∆/PaGDH-DAK में SA उत्पादन की तुलना की। 8). जैसा कि अपेक्षित था, ग्लिसरॉल की प्रारंभिक मात्रा में वृद्धि के साथ एसए टिटर में वृद्धि हुई; इस प्रकार, टाइटर्स के बीच तुलना सार्थक नहीं थी। इसके अलावा, जब 10 ग्राम/लीटर ग्लिसरॉल का उपयोग किया गया तो उपज सबसे कम थी। जब 20 ग्राम/लीटर और 30 ग्राम/लीटर ग्लिसरॉल का उपयोग किया गया तो पैदावार में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया; हालाँकि, जब 20 ग्राम/लीटर ग्लिसरॉल का उपयोग किया गया तो उत्पादकता सबसे अधिक थी। इस प्रकार, हमने एसए उत्पादन के लिए 20 ग्राम/लीटर ग्लूकोज के साथ उपयोग करने के लिए 50 ग्राम/लीटर ग्लिसरॉल को इष्टतम एकाग्रता माना है।

हमने हेक्सोकाइनेज को हटाकर ग्लिसरॉल की खपत पर ग्लूकोज के कैटाबोलाइट दमन को दूर करने का भी प्रयास किया, जो ग्लूकोज फास्फारिलीकरण दर को कम करने और ग्लूकोज और ज़ाइलोज़ के सह-उपयोग की अनुमति देने के लिए दिखाया गया था। एस। अनुमस्तिष्क²⁵. BLAST विश्लेषण के माध्यम से, तीन संभावित हेक्सोकाइनेज जीन (g1398, g2945, और g3837) निर्धारित किए गए थे, और केवल तनाव g3837∆/PaGDH-DAK में g3473 के विलोपन ने ग्लूकोज और ग्लिसरॉल (पूरक छवि) दोनों की एक साथ खपत को सक्षम किया। 9). जबकि समान एसए टाइटर्स प्राप्त किए जा सकते थे, जी3837 विलोपन ने ग्लूकोज और ग्लिसरॉल की खपत दर को कम कर दिया, जिससे उत्पादकता में कोई वृद्धि नहीं हुई।

फेड-बैच किण्वन और स्केल-अप

शेक फ्लास्क किण्वन के बाद, हमने एसए के अनुमापांक को बढ़ाने और बड़े पैमाने पर उत्पादन में हमारे इंजीनियर्ड स्ट्रेन के प्रदर्शन का आकलन करने के लिए फेड-बैच किण्वन किया। निम्न पीएच के प्रति बेहतर सहनशीलता का फायदा उठाने के लिए मैं. ओरिएंटलिस, हमने pH 3 पर फेड-बैच किण्वन करना चुना। इस pH पर, लगभग 90% SA प्रजातियाँ पूरी तरह से प्रोटोनेटेड SA हैं, जबकि शेष 10% प्रजातियाँ हाइड्रोजन सक्सिनेट हैं।²⁶. हमने सबसे पहले स्ट्रेन g3473∆/PaGDH-DAK के प्रदर्शन का परीक्षण किया, जिसे उच्च उत्पादकता के कारण g3473∆/nde∆/PaGDH-DAK के स्थान पर चुना गया, जिसमें 50 ग्राम/लीटर ग्लूकोज और 20 ग्राम/लीटर के साथ SC-URA माध्यम का उपयोग किया गया। 0.3 एल के आकार और 0.1 एल की कार्यशील मात्रा के साथ एक बेंच-टॉप बायोरिएक्टर में बैच किण्वन में ग्लिसरॉल, आंदोलन की स्थिर स्थितियों और ओ की निरंतर विरलता के तहत₂ और सह₂. हमने देखा कि सीओ के टाइटर्स (27.1 ग्राम/लीटर और 30.7 ग्राम/लीटर 0.333 वीवीएम (मात्रा प्रति कार्यशील आयतन प्रति मिनट) पर)₂ और सीओ का 0.667 वीवीएम₂, क्रमशः) शेक फ्लास्क किण्वन (42.1 ग्राम/ली) (पूरक चित्र) में प्राप्त अनुमापांक से बहुत कम थे। 10ए, बी). विशेष रूप से, जबकि एसए के समान टाइटर्स रिएक्टर और शेक फ्लास्क दोनों में ग्लूकोज से उत्पादित किए जा सकते थे, ग्लिसरॉल उपयोग चरण के दौरान उत्पादित एसए टाइटर्स बायोरिएक्टर में बहुत कम थे। हमने स्ट्रेन g3473∆/PaGDH-DAK/g3837∆ का उपयोग करके बायोरिएक्टर में बैच किण्वन भी किया और देखा कि यह स्ट्रेन ग्लिसरॉल खपत चरण के दौरान अधिक SA ​​का उत्पादन कर सकता है और O के 38.8 vvm पर SA का 0.167 g/L का टिटर प्राप्त किया जा सकता है।₂ और सीओ का 0.667 वीवीएम₂ (पूरक चित्र। 10सी, डी). हमने अनुमान लगाया कि जबकि ग्लिसरॉल का उपयोग बायोरिएक्टर वातावरण में शेक फ्लास्क वातावरण की तुलना में उच्च वातन के साथ किया जा रहा था, अधिक कार्बन प्रवाह को टीसीए चक्र में भेजा जा सकता था और एसए टिटर कम हो सकता था; दूसरी ओर, जी3837 को हटाने से टीसीए चक्र जीन की गतिविधि बाधित हो सकती है और एसए उत्पादन में सुधार हो सकता है। वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण को आरटीसीए मार्ग में जीन के ट्रांसक्रिप्शनल स्तर और टीसीए चक्र (साइट्रेट सिंथेज़) में कुछ चयनित जीन की तुलना करने के लिए नियोजित किया गया था। सीआईटी; एकोनिटेज़, ACO; और आइसोसाइट्रेट डिहाइड्रोजनेज, HDI) उपभेदों g3473∆/PaGDH-DAK में g3837 विलोपन के साथ या उसके बिना ग्लिसरॉल के साथ YP माध्यम में उगाया गया। हमने देखा कि जी3837 के नॉकआउट ने आरटीसीए मार्ग में जीन की समान अभिव्यक्ति को बनाए रखा लेकिन अभिव्यक्ति के स्तर को कम कर दिया। सीआईटी, का एक होमोलॉग ACO, तथा HDIs (पूरक चित्र। 11). इस प्रकार, टीसीए चक्र में जीन की कम गतिविधियों से बायोरिएक्टर में तनाव g3473∆/PaGDH-DAK/g3837∆ द्वारा प्राप्त उच्च एसए अनुमापांक हो सकता है। ग्लूकोज और ग्लिसरॉल फीडिंग के साथ SC-URA माध्यम में स्ट्रेन g3473∆/PaGDH-DAK/g3837∆ के फेड-बैच किण्वन से 109.5 g/g ग्लूकोज समतुल्य उपज और 0.65 g/ की उत्पादकता के साथ 0.54 g/L SA का उत्पादन हुआ। एल/एच (चित्र. 3A). किण्वन के अंत में, हमने क्रिस्टल का निर्माण देखा, जो संभवतः SA (पूरक चित्र) था। 12). जबकि अन्य कार्बनिक अम्ल, जैसे लैक्टिक और एसिटिक एसिड, पीएच 1-14 पर जलीय शोरबा में पूरी तरह से मिश्रणीय होते हैं, पीएच अधिक अम्लीय हो जाने पर एसए की घुलनशीलता कम हो जाती है।²⁷.

A ग्लूकोज और ग्लिसरॉल के साथ न्यूनतम माध्यम में स्ट्रेन g3473∆/PaGDH-DAK/g3873∆ का फेड-बैच किण्वन। B गन्ने के रस के माध्यम में स्ट्रेन g3473∆/PaGDH-DAK/ScSUC2 का फेड-बैच किण्वन। C एक पायलट-स्केल रिएक्टर में गन्ने के रस माध्यम में स्ट्रेन g3473∆/PaGDH-DAK/ScSUC2 का बैच किण्वन। स्रोत डेटा को स्रोत डेटा फ़ाइल के रूप में प्रदान किया जाता है।

पूर्ण आकार की छवि

हमारे पुनः संयोजक के उच्च किण्वक प्रदर्शन के बाद मैं. ओरिएंटलिस प्रयोगशाला में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले न्यूनतम माध्यम का उपयोग करके तनाव, फिर हमने एक वास्तविक औद्योगिक सब्सट्रेट, गन्ने के रस का उपयोग करके एसए के उत्पादन का परीक्षण किया। गन्ना सबसे अधिक ऊर्जा कुशल बारहमासी C4 पौधा है और स्विचग्रास और मिसकैंथस जैसी अन्य फसलों की तुलना में इसकी बायोमास उपज अधिक है।²⁸. इसके अलावा, सुक्रोज-आधारित फीडस्टॉक के रूप में गन्ने का रस, ग्लूकोज और स्टार्च-आधारित सब्सट्रेट जैसे मकई और कसावा से सस्ता है।²⁹. के बाद से मैं. ओरिएंटलिस सुक्रोज, इनवर्टेज का उपयोग करने में असमर्थ है एसयूसी2 से एस। अनुमस्तिष्क g3473∆/PaGDH-DAK में व्यक्त किया गया था। बैच किण्वन पहले 48 घंटों में हुआ, और एसए का उत्पादन 46.0 ग्राम/लीटर के अनुमापांक, 0.40 ग्राम/ग्राम ग्लूकोज के बराबर उपज और 0.96 ग्राम/लीटर/घंटा की उत्पादकता पर किया जा सकता है। बाद में संकेंद्रित गन्ने का रस पिलाने से, हमारा इंजीनियर्ड स्ट्रेन 104.6 ग्राम/लीटर के अनुमापांक पर एसए, 0.63 ग्राम/ग्राम ग्लूकोज के बराबर उपज और बेंच स्केल पर 1.25 ग्राम/लीटर/घंटा की उत्पादकता पैदा कर सकता है (चित्र)। 3B).

इसके अलावा, हमने गन्ने के रस का उपयोग करके अपनी एसए किण्वन प्रक्रिया को बेंच स्केल से पायलट स्केल तक बढ़ाया। यहां, हमने प्रति यूनिट वॉल्यूम में समान पावर इनपुट और बेंच-स्केल और पायलट-स्केल बायोरिएक्टर के बीच समान रेनॉल्ड्स संख्या बनाए रखने के लिए प्रक्रिया पैरामीटर निर्धारित किए, और बैच किण्वन 75 एल के आकार और एक कार्यशील पायलट-स्केल बायोरिएक्टर में किया गया था। बेंच-टॉप बायोरिएक्टर की तुलना में 30 एल की मात्रा या 300× का स्केल-अप फैक्टर। हमारा स्ट्रेन 63.1 ग्राम/लीटर अनुमापांक पर एसए, 0.50 ग्राम/ग्राम ग्लूकोज समतुल्य उपज और पीएच 0.66 पर 3 ग्राम/लीटर/घंटा की उत्पादकता उत्पन्न कर सकता है (चित्र)। 3C). मात्रा की आवश्यकता के कारण, हमने पायलट पैमाने पर फेड-बैच किण्वन का प्रयास नहीं किया; फिर भी, पायलट-स्केल बायोरिएक्टर में बैच किण्वन के लिए हमारा टिटर और उपज बेंच-स्केल बायोरिएक्टर के बराबर थी। इस प्रकार, हमने पायलट पैमाने पर फेड-बैच किण्वन में तनाव के समान प्रदर्शन की आशा की।

हमने दो-चरण वैक्यूम आसवन और क्रिस्टलीकरण का उपयोग करके गन्ने के रस किण्वन शोरबा से एसए को पुनर्प्राप्त करने के लिए एक डीएसपी तैयार करके एसए की पूर्ण उत्पादन प्रक्रिया को पूरा किया। पायलट-स्केल किण्वन से प्राप्त 63.1 ग्राम/एल एसए युक्त किण्वन शोरबा के और अधिक अम्लीकरण के बिना, पहले चरण के दौरान अधिकतम उपज 31.0% थी। चरण 1 से निस्यंद को फिर वैक्यूम आसवन का उपयोग करके इसकी मात्रा के 50% तक केंद्रित किया गया और क्रिस्टलीकरण के दूसरे चरण के अधीन किया गया। चरण 2 से एसए की उपज 47.7% थी, और दोनों चरणों के लिए समान मात्रा में एसए क्रिस्टल प्राप्त हुए (चरण 1.98 के लिए 1 ग्राम और चरण 2.10 के लिए 2 ग्राम)। इस प्रकार, दो-चरण वैक्यूम आसवन और क्रिस्टलीकरण के माध्यम से, कम-पीएच किण्वन शोरबा से 64.0% की समग्र एसए रिकवरी उपज प्राप्त की गई थी। इसके अलावा, चरण 1 और चरण 2 में पुनर्प्राप्त एसए क्रिस्टल की शुद्धता क्रमशः 88.9% और 86.23% होने का अनुमान लगाया गया था। प्राप्त परिणाम पिछले अध्ययन के निष्कर्षों के अनुरूप था³⁰. परिणामों से, यह स्पष्ट था कि अनुपचारित किण्वन शोरबा से उच्च शुद्धता (>85%) में एसए का क्रिस्टलीकरण सफल रहा। हालाँकि, वाणिज्यिक ग्रेड के एसए क्रिस्टल को पुनः प्राप्त करने के लिए रंग संबंधी अशुद्धियों को खत्म करने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता है।

तकनीकी-आर्थिक विश्लेषण और जीवन चक्र मूल्यांकन

हमने गन्ने को फीडस्टॉक के रूप में स्वीकार करने, इसे गन्ने के रस (सुक्रोज, ग्लूकोज और फ्रुक्टोज) में पवित्र करने, शर्करा को एसए में किण्वित करने में सक्षम एंड-टू-एंड बायोरिफाइनरियों को डिजाइन और सिम्युलेटेड किया। मैं. ओरिएंटलिस, और सूखे एसए क्रिस्टल को पुनर्प्राप्त करने के लिए किण्वन शोरबा को अलग करना (पूरक चित्र)। 13) 26,800 मीट्रिक टन एसए की वार्षिक उत्पादन क्षमता पर (2013 में एसए की वैश्विक मांग लगभग 76,000 मीट्रिक टन थी)³¹). प्रयोगशाला-स्केल बैच मोड (प्रयोगशाला बैच परिदृश्य) और फेड-बैच मोड (प्रयोगशाला फेड-बैच परिदृश्य) प्रयोगों के साथ-साथ प्राप्त किण्वन प्रदर्शन के अनुरूप उपज, अनुमापांक और उत्पादकता की धारणाओं के साथ वैकल्पिक किण्वन परिदृश्यों के तहत बायोरिफाइनरियों का अनुकरण किया गया था। पायलट-स्केल बैच मोड सेटअप (पायलट बैच परिदृश्य)। विकसित एसए मार्गों की वित्तीय व्यवहार्यता और पर्यावरणीय लाभों को चिह्नित करने के लिए, हमने बेसलाइन मान्यताओं के साथ-साथ अनिश्चितता के तहत प्रत्येक परिदृश्य के लिए टीईए और एलसीए का प्रदर्शन किया (लैटिन हाइपरक्यूब नमूनाकरण के साथ प्रत्येक परिदृश्य के लिए 2000 मोंटे कार्लो सिमुलेशन; वैकल्पिक संख्याओं पर परिणामों का वितरण) मोंटे कार्लो सिमुलेशन की जानकारी पूरक तालिका में दी गई है 1 और प्रत्येक परिदृश्य के लिए सभी अनिश्चित मापदंडों के अनुमानित आधारभूत मान और वितरण पूरक डेटा में रिपोर्ट किए गए हैं 1). हमने न्यूनतम उत्पाद बिक्री मूल्य (एमपीएसपी, 2016 में 10% की आंतरिक वापसी दर के साथ $), 100-वर्षीय ग्लोबल वार्मिंग क्षमता (जीडब्ल्यूपी) का उपयोग किया₁₀₀; टीईए और एलसीए परिणामों को दर्शाने के लिए मेट्रिक्स के रूप में क्रैडल-टू-ग्रेव), और जीवाश्म ऊर्जा खपत (एफईसी; क्रैडल-टू-गेट)। हमने उत्पादन लागत और पर्यावरणीय प्रभावों के प्रमुख चालकों की पहचान करने के लिए स्पीयरमैन के रैंक ऑर्डर सहसंबंध गुणांक (स्पीयरमैन के ρ) का उपयोग करके संवेदनशीलता विश्लेषण भी किया। अंत में, वित्तीय व्यवहार्यता और पर्यावरणीय स्थिरता में और सुधार के लिए लक्ष्य निर्धारित करने और प्राथमिकता देने के लिए, हमने संभावित किण्वन प्रदर्शन परिदृश्य में बायोरिफाइनरियों को डिजाइन और सिम्युलेटेड किया (यानी, तटस्थ और निम्न-पीएच किण्वन दोनों के लिए उत्पादकता की एक श्रृंखला में प्रत्येक में 2500 उपज-अनुमापांक संयोजन)। ).

प्रयोगशाला बैच परिदृश्य में प्रायोगिक प्रदर्शन के आधार पर, बायोरिफाइनरी $1.70/किग्रा (बेसलाइन; चित्र) के अनुमानित एमपीएसपी पर एसए का उत्पादन कर सकती है। 4A) $1.51-1.92/किग्रा (5वां-95वां प्रतिशत; इसके बाद कोष्ठक में) की सीमा के साथ। बायोरिफाइनरी का GWP₁₀₀ और इस परिदृश्य के तहत एफईसी 1.95 किलोग्राम सीओ होने का अनुमान लगाया गया था₂-eq./किग्रा (1.37-2.65 किग्रा सीओ₂-eq./kg) और -3.74 MJ/kg (−12.9–5.39 MJ/kg), क्रमशः (चित्र)। 4B और अनुपूरक चित्र। 14). प्रयोगशाला फेड-बैच परिदृश्य में (प्रयोगशाला बैच परिदृश्य की तुलना में बेहतर किण्वन एसए टिटर, उपज और उत्पादकता के साथ), बायोरिफाइनरी का एमपीएसपी $1.06/किग्रा ($0.96-1.22/किग्रा), जीडब्ल्यूपी था₁₀₀ 0.93 किग्रा CO था₂-eq./किग्रा (0.71-1.32 किग्रा सीओ₂-eq./kg), और FEC −5.36 MJ/kg (−8.97–0.213 MJ/kg) था। पायलट बैच परिदृश्य में (प्रयोगशाला बैच परिदृश्य के सापेक्ष किण्वन एसए उपज और टिटर में सुधार हुआ लेकिन प्रयोगशाला फेड-बैच परिदृश्य की तुलना में कम, और दोनों प्रयोगशाला परिदृश्यों की तुलना में कम उत्पादकता के साथ), बायोरिफाइनरी का अनुमानित एमपीएसपी $1.37/किग्रा था ($1.23–1.54/किग्रा), जीडब्ल्यूपी₁₀₀ 1.67 कि.ग्रा. CO₂-eq./किग्रा (1.22-2.17 किग्रा सीओ₂-eq./kg), और FEC −0.21 MJ/kg (−7.08 से 6.47 MJ/kg)। इस परिदृश्य के लिए बायोरिफाइनरी के माध्यम से कार्बन के प्रवाह को दर्शाने वाला एक सैंकी आरेख भी पूरक चित्र में दिखाया गया था। 15.

अनिश्चितताएं (बॉक्स और व्हिस्कर प्लॉट) और ब्रेकडाउन (स्टैक्ड बार चार्ट) (A) न्यूनतम उत्पाद विक्रय मूल्य (एमपीएसपी) और (B) पालने से कब्र तक 100 साल की ग्लोबल वार्मिंग क्षमता (जीडब्ल्यूपी₁₀₀). मूंछें, बक्से और मध्य रेखा 5 मोंटे कार्लो सिमुलेशन से 95वें/25वें, 75वें/50वें, और 2000वें प्रतिशतक का प्रतिनिधित्व करते हैं (n = 2000 सिमुलेशन) प्रत्येक परिदृश्य के लिए। पेंटागन, स्क्वायर और डायमंड मार्कर क्रमशः प्रयोगशाला बैच (लैब. बैच) प्रयोगशाला फेड-बैच (लैब. फेड-बैच), और पायलट बैच (पायलट बैच) परिदृश्यों के लिए आधारभूत परिणामों का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्टैक्ड बार चार्ट पायलट बैच परिदृश्य के लिए आधारभूत परिणामों की रिपोर्ट करते हैं; अन्य परिदृश्यों के परिणाम एसआई में शामिल हैं। बिजली की खपत में केवल सिस्टम की खपत शामिल है; चित्र की स्पष्टता के लिए चित्रित ब्रेकडाउन में उत्पादन को बाहर रखा गया था। सामग्री और स्थापित उपकरण लागत, हीटिंग और कूलिंग कर्तव्यों, बिजली के उपयोग, जीडब्ल्यूपी के लिए सारणीबद्ध ब्रेकडाउन डेटा₁₀₀, और FEC ऑनलाइन उपलब्ध हैं⁶². लेबल वाली गहरे भूरे रंग की रेखाएं जीवाश्म-आधारित उत्पादन मार्गों के लिए रिपोर्ट किए गए प्रभावों को दर्शाती हैं (f1⁵²; f2-f4⁵¹). लेबल वाली हल्की ग्रे रेखाएं वैकल्पिक जैव-आधारित उत्पादन मार्गों (बी1) के लिए रिपोर्ट किए गए प्रभावों को दर्शाती हैं⁵¹; बी2⁵³; बी3⁵²). जहां जीडब्ल्यूपी₁₀₀ क्रैडल-टू-गेट के रूप में रिपोर्ट किया गया था, इस अध्ययन और डन एट अल के साथ स्थिरता के लिए जीवन के अंत के प्रभावों के रूप में 1.49 किलोग्राम CO2-eq./kg जोड़ा गया था। 2015. सभी रिपोर्ट किए गए एमपीएसपी के मूल्य और समायोजन से पहले और बाद के प्रभावों को पूरक तालिका में सूचीबद्ध किया गया है 3 और 4। (C, D) एमपीएसपी और (E, F) जीडब्ल्यूपी₁₀₀ तटस्थ (बाएं पैनल) के लिए पायलट बैच परिदृश्य (2500 ग्राम/ली/घंटा) की आधारभूत उत्पादकता पर 0.66 किण्वन उपज-अनुमापांक संयोजन; C, E) और निम्न-पीएच (दायां पैनल; D, F) किण्वन. उपज को सैद्धांतिक अधिकतम (%सैद्धांतिक) के % के रूप में दिखाया गया है जिसे सैद्धांतिक अधिकतम उपज 1.31 ग्राम/जी-ग्लूकोज-समतुल्य (कार्बन संतुलन के आधार पर) तक बढ़ाया गया है। चित्र पर दिए गए बिंदु के लिए, x-अक्ष मान उपज का प्रतिनिधित्व करता है, y-अक्ष मान टिटर का प्रतिनिधित्व करता है, और रंग और समोच्च रेखाएं एमपीएसपी, जीडब्ल्यूपी के मान का प्रतिनिधित्व करती हैं₁₀₀. डायमंड मार्कर पायलट बैच परिदृश्य के लिए आधारभूत परिणाम दिखाते हैं। स्रोत डेटा को स्रोत डेटा फ़ाइल के रूप में प्रदान किया जाता है।

पूर्ण आकार की छवि

पायलट बैच परिदृश्य के लिए जिन 28 मापदंडों को अनिश्चितता के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था, उनमें हमने पाया कि एमपीएसपी किण्वन एसए उपज के प्रति सबसे अधिक संवेदनशील था (स्पीयरमैन का ρ -0.60; सभी अनिश्चितता वितरण पूरक डेटा में सूचीबद्ध हैं) 1 और सभी मापदंडों के लिए स्पीयरमैन के ρ मान अनुपूरक तालिका में बताए गए हैं 2). एमपीएसपी फ़ीड गन्ना इकाई मूल्य (स्पीयरमैन का ρ 0.39), प्लांट अपटाइम (−0.38), गन्ना फ़ीड के लिए संयंत्र की क्षमता (−0.31), और किण्वन एसए टिटर (−0.30) के प्रति भी काफी संवेदनशील था। जीडब्ल्यूपी₁₀₀ बॉयलर दक्षता के प्रति सबसे अधिक संवेदनशील था (स्पीयरमैन का ρ -0.63)। जीडब्ल्यूपी₁₀₀ किण्वन एसए अनुमापांक और उपज के प्रति भी काफी संवेदनशील था, स्पीयरमैन के ρ मान क्रमशः −0.62 और 0.32 थे। एफईसी किण्वन एसए उपज (स्पीयरमैन का ρ 0.63) के प्रति सबसे अधिक संवेदनशील था, और बॉयलर दक्षता (−0.56) और किण्वन एसए टिटर (−0.49) के प्रति भी संवेदनशील था। किण्वन प्रदर्शन के निहितार्थों को और अधिक स्पष्ट करने के लिए, हमने किण्वन प्रदर्शन परिदृश्य में टीईए और एलसीए का प्रदर्शन किया (चित्र)। 4C-एफ और अनुपूरक चित्र। 14बी, सी), दो वैकल्पिक शासनों में से प्रत्येक के लिए उत्पादकता की एक श्रृंखला में 2500 उपज-अनुमापांक संयोजनों का अनुकरण: निम्न-पीएच किण्वन (यानी, किण्वन के दौरान आधार जोड़ का उपयोग करके 3 के पीएच पर किण्वन को नियंत्रित किया जाता है और किण्वन के बाद कोई अम्लीकरण की आवश्यकता नहीं होती है) और तटस्थ किण्वन (अर्थात, किण्वन के दौरान आधार जोड़ द्वारा एसए के पूर्ण निष्प्रभावीकरण और किण्वन के बाद पूर्ण पुन: अम्लीकरण के साथ)। किण्वन के बाद आवश्यक पुनः अम्लीकरण के साथ एक वैकल्पिक निम्न-पीएच परिदृश्य के परिणाम पूरक चित्र में दिखाए गए थे। 16.

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• स्रोत: https://www.nature.com/articles/s41467-023-41616-9