Un dépistage à l'échelle du génome dans des cellules pluripotentes identifie Mtf1 comme un suppresseur de la toxicité de la huntingtine mutante - Nature Communications

Culture de cellules

Lignes ESC de souris (Rex1GFP-d2 et E14IVc¹³⁷) ont été cultivés dans des conditions sans feeder [plastique recouvert de 0.2 % de gélatine (Sigma, cat. G1890)] et réensemencés tous les 3 à 4 jours selon un rapport de fractionnement de 1:10 après dissociation avec Accutase (GE Healthcare, cat. L11-007 ) ou 0.25 % de trypsine (Life Technologies). Les cellules ont été cultivées dans un milieu à base de N2B27 sans sérum [DMEM/F12 et Neurobasal dans un rapport 1:1, 0.1 mM de β-mercaptoéthanol, 2 mM de L-glutamine, 1:200 N2 et 1:100 B27 (tous les réactifs de Life Technologies )] ou milieu KSR contenant du sérum [GMEM (Sigma, cat. G5154) additionné de 10% KSR (Life Technologies), 2% FBS (Sigma, cat. F7524), 100 mM β-mercaptoéthanol (Sigma, cat. M7522) , 1 × acides aminés non essentiels MEM (Invitrogen, cat. 1140-036), L-glutamine 2 mM, pyruvate de sodium 1 mM (tous deux d'Invitrogen)], complétés par deux inhibiteurs à petites molécules (2i) PD (PD0325901, 1 μM), CH (CHIR99021, 3 μM) d'Axon (cat. 1386 et 1408) et LIF (100 unités/mL achetés chez Qkine - Cambridge UK).

Les iPSC humains CS09iHD-109n5 (ici appelés iPSC_Q109) et CS14iCTR-21n3 (ici appelés iPSC_Q21) achetés auprès de Cedars-Sinai Biomanufacturing Center (Los Angeles, Californie), ont été maintenus sur du Matrigel à 0.5 % pré-enduit (CORNING, cat. 356231 ) plaques en milieu E8 fabriquées en interne (d'après Chen et al., 2011¹³⁸) ou en mTeSR (StemCell Technologies, cat. 05850) à 37 °C, 5 % O², 5% CO². Les CSPi humaines ont été dissociées en amas avec de l'EDTA 0.5, 99260 mM (Gibco, cat. AM1G) et replaquées à une dilution de 6: 3 tous les 4-10 jours avec un inhibiteur de ROCK 27632 μM (Y1683-dichlorhydrate Axon Medchem, cat. 24) pendant XNUMX heures. Le médium était changé tous les jours. Toutes les lignées cellulaires étaient mycoplasmes négatives.

Génotypage de iPSC_Q21 et iPSC_Q109

L'ADN génomique de iPSC_Q21 et iPSC_Q109 a été isolé à l'aide du kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, cat. 69504) en suivant les instructions du fabricant et quantifié par Nanodrop ND-1000. La PCR a été réalisée à l'aide des amorces répertoriées dans le tableau supplémentaire 1 et décrit dans Mangiarini et al.²⁹, conçu pour amplifier le tractus polyQ dans l'exon 1 HTT. Pour une réaction de 25 μL, nous avons utilisé 200 ng d'ADN génomique, 0.25 μL de Taq Phusion High fidelity (ThermoFisher, cat. F-530L), 2.5 μL de Buffer GC 5x + MgCl² (7.5 mM), 2 μL de dNTP (10 mM) et 1.25 μL de Diméthylsulfoxyde (DMSO, 100%). Après 3 minutes à 94°C, nous avons effectué 35 cycles de : 94°C pendant 1 minute, 63°C pendant 45 secondes, 72°C pendant 1 minute, suivi d'une élongation finale à 70°C pendant 7 minutes. L'électrophorèse sur gel a été réalisée sur gel d'agarose à 2.5%, en chargeant 20 μL de produits PCR avec du Purple Loading Dye 6x (NEB, cat. B7024S). La β-actine a été utilisée comme contrôle de chargement. Les résultats ont été acquis numériquement par VWR Imager CHEMI Premium.

Génération de lignes ESC exprimant HTT

Les cellules Q15 et Q128 ont été générées par transfection d'ADN de vecteurs contenant le N-terminal du gène huntingtin humain, avec respectivement 128 ou 15 répétitions CAG (avec l'aimable autorisation du professeur Elena Cattaneo). La linéarisation d'une nuit de l'ADN plasmidique a été réalisée avec l'enzyme de restriction PvuI. Pour la transfection d'ADN, nous avons utilisé Lipofectamine 2000 (Life Technologies, cat. 11668-019) et effectué une transfection inverse. Pour un puits d'une plaque à 6 puits, nous avons utilisé 6 μl de réactif de transfection, 2 μg d'ADN plasmidique et 300,000 2 cellules dans 1 mL de milieu. Le milieu a été changé après une nuit d'incubation. La sélection antibiotique (Puromycine 24 μg/mL) a commencé XNUMX heures après la transfection.

Génération d'ESC de souris exprimant de manière stable des gènes d'intérêt

Des CSE de souris transgéniques stables exprimant des candidats ont été générés en transfectant des cellules exprimant HTT avec des plasmides de transposon PB (1 μg de CAG-Mtf1, CAG-Kdm2b, CAG-Kdm5b et CAG-Fbxo34), achetés auprès de VectorBuilder (VectorBuilder Inc, Chicago, IL, USA), avec le vecteur d'expression de la transposase PB pBase (1 µg). Nous avons utilisé Lipofectamine 2000 et effectué une transfection inverse comme décrit pour la génération de lignées HD. La sélection antibiotique (Hygromycine B, 150 μg/mL ; Invitrogen, cat. 10687010) a commencé 24 heures après la transfection.

Différenciation des PNJ

iPSC_Q21 et iPSC_Q109 ont été différenciés en NPC selon Li et al., 2011⁹² protocole. Les CSPi à 80 % de confluence ont été dissociées en cellules individuelles avec Accutase (Gibco, cat. A1110-501) et étalées à 45,000 XNUMX cellules/cm² en milieu E8 avec 10 μM d'inhibiteur de ROCK. Après 1 jour, le milieu E8 a été remplacé par du milieu d'induction N2B27 composé de Advanced DMEM/F12 (Gibco, cat. 12634-010) : Neurobasal (Gibco, cat. 21103-049) (ratio 1:1), BSA 50 mg/mL (Gibco, cat. 15260-037), Glutamax 1 % (Gibco, cat. 35050-038), Pénicilline/Streptomycine 1 % (Gibco, cat. 15140122), Supplément N2 1:200 (Gibco, cat. 17502-048) , Supplément B27 1:100 (Gibco, cat. 17504-044), additionné de petites molécules de LIF humain 10 ng/mL (Qkine, cat. Qk036), SB431542 2 μM (Axon Medchem, cat. 1661), CHIR99021 3 μM ( Axon Medchem, cat. 1386), Composé E 0.1 µM (Sigma-Aldrich, cat. 209986-17-4). Le milieu d'induction N2B27 a été changé tous les jours, pendant 7 jours. Au jour 7, les PNJ ont été divisés à une dilution de 1: 6 dans un milieu de maintenance N2B27 composé de Advanced DMEM / F12 (Gibco, cat. 12634-010): Neurobasal (Gibco, cat. 21103-049) (rapport 1: 1) , BSA 50 mg/mL (Gibco, cat. 15260-037), Glutamax 1 % (Gibco, cat. 35050-038), Pénicilline/Streptomycine 1 % (Gibco, cat. 15140122), Supplément N2 1:200 (Gibco, cat. 17502-048), Supplément B27 1:100 (Gibco, cat. 17504-044), additionné de petites molécules de LIF humain 10 ng/ml (Qkine, cat. Qk036), SB431542 2 μM (Axon Medchem, cat. 1661 ), CHIR99021 3 μM (Axon Medchem, cat. 1386), supplémenté en EGF 20 ng/mL (R&D, cat. 236-EG) et FGF2 20 ng/mL (Qkine, cat. Qk002, recombinant zebrafish FGF2). Les PNJ ont été maintenus pendant 6 passages. Les données de morphologie des h-iPSC et des PNJ ont été collectées numériquement avec le microscope Zeiss Axio Vert A1 FL-LED.

Génération de PNJ exprimant de manière transitoire des gènes d'intérêt

Pour la transfection d'ADN, 250,000 1110 PNJ ont été dissociés sous forme de cellules individuelles avec Accutase (Gibco, cat. A501-1) et ont été transfectés avec des constructions PB (2311 μg) à l'aide de FuGENE HD Transfection (Promega, cat. E12), en suivant le protocole de transfection inverse . Pour un puits d'une plaque de 3.9 puits, nous avons utilisé 1 μL de réactif de transfection, 250,000 μg d'ADN plasmidique et 1 2 cellules dans 27 mL de milieu de maintenance N10B27632 avec 1683 μM de Y48 [ROCKi, Rho-associated kinase (ROCK) inhibiteur, Chat Axone Medchem. 30]. Le milieu a été changé après une nuit d'incubation. Après 24 heures après la transfection, les cellules ont été traitées avec de la Roténone XNUMX µM pendant XNUMX heures puis analysées comme indiqué sur la Fig. 8f.

Test de prolifération

Les CSE de souris ont été conditionnées pour un passage en milieu KSR + 2iL en présence de Puromycine 6 μg/mL. La prolifération des ESC a été évaluée en étalant 15,000 24 cellules dans une plaque de 7,500 puits (XNUMX XNUMX cellules/cm²) en milieu KSR + 2iL en présence de Puromycine 6 μg/mL. Les cellules ont été dissociées avec 0.25 % de trypsine (Life Technologies) et comptées toutes les 24 heures pendant 4 jours.

La prolifération des CSPi a été mesurée en étalant 40,000 0.5 cellules individuelles sur des plaques à 356231 puits pré-enduites de Matrigel à 12 % (CORNING, cat. 11,428) (XNUMX XNUMX cellules/cm²) dans du milieu E8 avec 10 µM d'inhibiteur ROCK (Y27632-dichlorhydrate, Axon Medchem, cat. 1683) pendant 24 heures. Le médium était changé tous les jours. Les cellules ont été dissociées avec Accutase (GE Healthcare, cat. L11-007) et comptées toutes les 24 heures pendant 4 jours.

La prolifération des PNJ a été mesurée en étalant 100,000 0.5 cellules sur des plaques de Matrigel à 356231 % pré-enduites (CORNING, cat. 12) à 28,571 puits (XNUMX XNUMX cellules/cm²) dans du milieu d'entretien N2B27 avec 10 µM d'inhibiteur ROCK (Y27632-dichlorhydrate Axon Medchem, cat. 1683) pendant 24 heures. Les cellules ont été dissociées avec Accutase (GE Healthcare, cat. L11-007) et comptées toutes les 24 heures pendant 4 jours.

Traitement des facteurs de stress et coloration au cristal violet (CV)

Pour les expériences des Fig. 2b, 5,000 24 ESC de souris ont été étalées dans une plaque de 2,500 puits (XNUMX XNUMX cellules/cm²) en milieu KSR + 2iL en présence des inhibiteurs (et Puromycine 6 μg/ml) pendant 48h et scoré par quantification du nombre de cellules survivantes par coloration CV [Solution CV : 0.05% w/v Crystal Violet (Sigma) , 1% de solution de formaldéhyde 37% (Sigma), 1% de méthanol, 10% PBS] et la quantification de l'intensité moyenne a été réalisée avec le logiciel Fiji (v2.0.0).

Pour la mutagenèse PB suivie de traitements contre les facteurs de stress, les cellules ont été étalées à une densité de 2,500 XNUMX cellules/cm² en Puromycine 6 μg/mL et sélectionnés pendant 5 jours en présence de MG132 (Sigma-Aldrich, cat. C2211) ou de Tamoxifène (Sigma-Aldrich, cat. T2859).

Pour les expériences de la Fig. 4g, 5,000 24 cellules ont été étalées dans une plaque de 2 puits dans du milieu KSR + 3iL avec Puromycin 132 μg/mL. Des facteurs de stress (MG12.5 13.4 nM ou Tamoxifène 12 µM) ont été ajoutés après XNUMX heures. La notation des cellules survivantes a été réalisée comme décrit ci-dessus.

Pour les expériences de la Fig. 4d, 2,500 48 cellules ont été étalées dans une plaque de 2 puits dans du milieu KSR + 8875iL. Agents de stress [roténone (Sigma-Aldrich, cat. R247502), cumène (Sigma-Aldrich, cat. 5), 1287-azacytidine (Sigma-Aldrich, cat. A132), MG2211 (Sigma-Aldrich, cat. C1793), bafilomycine ( Sigma-Aldrich, cat. B6942), Staurosporine (Sigma-Aldrich, cat. S2859), Tamoxifène (Sigma-Aldrich, cat. T12)] ont été ajoutés après 48 heures aux concentrations indiquées. Après XNUMX heures, les cellules survivantes ont été colorées avec une solution CV, la notation des cellules survivantes a été effectuée comme décrit ci-dessus.

Électroporation du système PB dans les ESC

Une mutagenèse médiée par le PB par électroporation a été réalisée pour un criblage à l'échelle du génome. Les vecteurs PB s'intègrent de manière stable dans le génome après insertion aléatoire dans les sites TTAA. Le vecteur PB pGG134 utilisé (illustré à la Fig. 2a) a été optimisé pour les écrans à gain de fonction⁵⁴: il consiste en l'enhancer/promoteur MSCV suivi d'un site donneur d'épissage de l'exon 1 de Foxf2 gène, ce qui permet la suractivation des gènes voisins. Le PB 5'-ITR a également une faible activité de promoteur directionnel, c'est-à-dire que cette construction peut activer des gènes dans l'une ou l'autre orientation. Le vecteur contient également une deuxième cassette, comprenant un promoteur constitutif suivi des gènes de résistance DsRed et hygromycine, qui a été utilisé pour identifier les cellules avec une intégration stable du vecteur.

Nous avons optimisé les conditions afin d'obtenir un faible nombre d'événements d'intégration, en ajustant le rapport vecteur PB vs transposase pBase. Pour la procédure de criblage, la mutagenèse a été réalisée en utilisant la quantité optimisée de 0.5 μg de pGG134 et 20 μg de pBase.

Pour une seule électroporation, 10⁷ les cellules et 20.5 μg d'ADN ont été mélangés et placés dans une cuvette d'électroporation (Biorad Gene Pulser Cuvette, cat. 165-2088). Les cellules ont été électroporées en plaçant la cuvette dans le support d'électroporation du Biorad GenePulser (cat. 165-2076). Réglages utilisés : 250 V, 500 μF, la constante de temps doit être comprise entre 5.6 et 7.5. Les cellules électroporées ont été délicatement récupérées des cuvettes et étalées. La sélection antibiotique a commencé 24 heures après l'électroporation.

Extraction d'ADN génomique et Splinkerette-PCR

Les cellules ont été récoltées et incubées pendant une nuit à 56 °C avec un tampon de lyse [Tris-HCl 10 mM, pH 7.5 ; EDTA 10 mM; NaCl 10 mM; 0.5 % p/v de Sarcosyl, additionné de protéinase K (Sigma, cat. P2308) à une concentration finale de 1 mg/mL]. Afin d'obtenir des précipités d'ADN, le lendemain, 2 mL d'un mélange de NaCl et d'éthanol (30 µL de NaCl 5 M mélangés à 20 mL d'éthanol absolu froid) ont été ajoutés. Les extraits cellulaires ont été centrifugés pendant 45 minutes à 4°C pour éliminer la fraction soluble. L'ADNg précipité a été rincé trois fois en égouttant 2 mL d'éthanol à 70 % et finalement remis en suspension dans de l'eau milliQ à 70 °C.

La procédure Splinkerette-PCR pour la cartographie d'intégration PB a été adaptée de Potter et Luo ¹³⁹ et consistait en les étapes suivantes : a) 2 μg d'ADN génomique ont été digérés avec 10 U BstYI (10,000 30 U/mL, NEB) dans un volume de 60 μL. La réaction a été incubée à 80°C pendant une nuit, le jour suivant l'enzyme a été inactivée à 20°C pendant 150 minutes. Les adaptateurs pour Splinkerette-PCR ont été générés par recuit de XNUMX pmol d'amorces AdapterA et B (tableau supplémentaire 1) dans un volume final de 100 μL (10x NEB Buffer 2). Les oligos ont été dénaturés à 65°C pendant 5 min, puis refroidis ; b) La ligature a été réalisée dans un volume total de 6 μl comprenant un mélange de ligature 2x (Takara), 2.5 μL d'ADNg digéré et 0.5 μL d'adaptateurs recuits pour Splinkerette-PCR. La réaction de ligature a été incubée à 16°C pendant une nuit, le lendemain à 65°C pendant 10 minutes pour l'inactivation de l'enzyme. Une étape de purification a été incluse avant l'étape C, en utilisant le kit de purification QIaquick PCR, en suivant les instructions du fabricant. Pour les amplifications par PCR, nous avons utilisé Phusion HF DNA Pol (NEB) dans 5x Phusion GC Buffer recommandé dans le cas de modèles riches en GC ou avec des structures secondaires. Le mélange PCR comprenait 5x tampon GC, 10 mM de dNTP, DMSO et Phusion Pol ; c) La PCR du premier tour a été amplifiée avec 15 μL d'ADN ligaturé (ou 50 % du produit de ligation pour chaque réaction pour les jonctions transposon/hôte PB5' et PB3'), 0.5 μM pour chaque amorce (Adaptor-PCR1 et PB5' ou PB3' -ITR PCR1), 6.5 μL de mélange PCR, volume final de 25 μL. Programme Splinkerette-PCR1 : 95 °C pendant 2 minutes ; deux cycles de 95°C pendant 20 secondes, 65°C pendant 30 secondes, 68°C pendant 2 minutes ; puis 30 cycles de 95°C pendant 30 secondes, 60°C pendant 30 secondes, 68°C pendant 2 minutes ; puis 68 °C pendant 10 minutes ; d) Pour la PCR de deuxième tour, nous avons utilisé 5 μL de dilution 1:500 du produit PCR1, 0.5 μM pour chaque amorce (Adapter-PCR2 et PB5' ou PB3'-ITR PCR2), 6.5 μL de mélange PCR, volume final de 25 μL . Programme Splinkerette-PCR2 : 95 °C pendant 2 minutes ; deux cycles de 95°C pendant 20 secondes, 65°C pendant 30 secondes, 68°C pendant 2 minutes ; puis 5 cycles de 95°C pendant 30 secondes, 60°C pendant 30 secondes, 68°C pendant 2 minutes ; puis 25 cycles de 95°C pendant 30 secondes, 58°C pendant 30 secondes, 68°C pendant 2 minutes ; puis 68 °C pendant 10 minutes ; e) Les produits PCR2 ont été traités avec la phosphatase antarctique et l'exonucléase I (toutes deux de NEB) et séquencés à l'aide des amorces PCR5 PB3'- ou PB2'-ITR. Les amorces et les séquences d'adaptateurs sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 1.

Analyse de séquençage de nouvelle génération des sites d'intégration génomique

L'ADN génomique de populations entières de mutants a été extrait à l'aide d'un kit de cellules Gentra Puregene. La préparation et le séquençage de la bibliothèque ont été effectués comme décrit précédemment¹⁴⁰. Un pipeline bioinformatique sur mesure a permis de cartographier chaque lecture à un locus génomique et d'associer chaque site d'intégration à un gène à moins de 20 kb de distance. Les données ont ensuite été organisées dans le réseau de gènes d'interaction HD au moyen du logiciel Cytoscape (v3.8.2)¹⁴¹.

Coloration à l'iodure de propidium (PI)

La coloration PI a été réalisée sur des CSE de souris uniques vivantes conformément aux instructions du fabricant (Ebioscience, cat. 88-8007-72). Après lavage au PBS, 10⁵ les cellules vivantes ont été remises en suspension dans 200 μL de tampon de liaison 1x et 5 μL de solution de coloration PI (cat. 00-6990) ont été ajoutés. L'analyse par cytométrie en flux a été réalisée à l'aide d'un BD FACSCanto^TM II cytomètre en 1 heure, en stockant les échantillons à 2-8 °C dans l'obscurité. Les données ont été analysées avec BD FACSDiva^TM (v. 9.0) et les logiciels FlowJo (10.8.1). Une stratégie de déclenchement représentative est disponible dans la Fig. 10.

Essai de mesure de ROS

La production de ROS a été détectée en colorant des ESC de souris vivantes et des cellules de PNJ humaines avec du diacétate de 2′, 7′-dichlorodihydrofluorescéine (H₂DCFDA ; Technologies de la vie, cat. D399), en réalisant les étapes suivantes : a) L'indicateur ROS a été fraîchement reconstitué pour faire une solution mère concentrée (10 mM) ; b) 3-5×10⁵ les cellules ont été récoltées, c) lavées une fois avec 500 μL de PBS et d) remises en suspension dans 300 μL de PBS contenant la sonde pour fournir une concentration de travail finale de 0.5 μM de colorant ; e) les cellules ont été incubées à 37°C pendant 10 minutes dans l'obscurité ; f) après élimination de la solution de coloration, les échantillons ont été g) lavés deux fois dans du PBS. Les échantillons ont été prélevés par cytométrie en flux à l'aide d'un BD FACSCanto^TM II ou BIO-RAD S3e Cell Sorter et l'analyse a été effectuée avec BD FACSDiva^TM (v. 9.0), ProSort^TM (v. 1.6) et les logiciels FlowJo (10.8.1). Une stratégie de déclenchement représentative est disponible dans la Fig. 10b-c.

Coloration à l'annexine V

Des PNJ vivants, transitoirement transfectés avec le gène d'intérêt et traités à la Roténone 30 μM pendant 24 heures, ont été colorés à l'Annexine V selon les instructions du fabricant (Ebioscience, cat. 88-8007-72). Les cellules ont été lavées une fois dans du PBS, puis une fois dans du tampon de liaison 1x (cat. 00-0055). 5×10⁵ les cellules ont été remises en suspension dans 200 μl de tampon de liaison 1x et incubées avec 5 μl d'annexine V conjuguée au fluorochrome (cat. 17-8007) pendant 10 minutes à température ambiante. Les cellules ont ensuite été lavées dans 500 μL de tampon de liaison 1x. Enfin, les cellules ont été remises en suspension dans 200 μL de tampon de liaison 1x. L'analyse par cytométrie en flux a été effectuée à l'aide du trieur de cellules BIO-RAD S3e en 1 heure, en stockant les échantillons à 2-8 ° C dans l'obscurité. Les données ont été analysées avec ProSort^TM (v. 1.6) et les logiciels FlowJo (10.8.1). Une stratégie de déclenchement représentative est disponible dans la Fig. 10c.

Western Blot

Les cellules ont été lavées dans du PBS froid et récoltées dans du tampon de lyse (50 mM Hepes pH 7.8, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 % NP40, 5 % glycérol), fraîchement additionné de 1 mM DTT, inhibiteur de protéase (Roche, cat. 39802300 ) et inhibiteur de la phosphatase (Sigma-Aldrich, cat. P5726). Les échantillons ont été exposés à des ultrasons dans un sonicateur (Diagenode Bioruptor) et centrifugés à 15,871 10 rcf pendant XNUMX minutes pour préparer le surnageant. La concentration en protéines a été déterminée par quantification de Bradford. Pour les expériences des Fig. 1b, 2g, 4d et Fig supplémentaire. 1d, la protéine totale (10 µg) a été fractionnée sur un gel d'acrylamide Nupage MOPS 4-12 % (Life Technologies, cat. BG04125BOX/BG00105BOX) et transférée par électrophorèse sur une membrane PVDF (Millipore, cat. IPFL00010) dans une solution de transfert (50 mM Tris -HCl, glycine 40 mM, méthanol 20 %, SDS 0.04 %. Les membranes ont ensuite été saturées avec du lait écrémé en poudre à 5 % (BioRad ; 170-6405-MSDS) dans du TBST (8 g de NaCl, 2.4 g de Tris-HCl, 0.1 % de Tween20/litre, pH 7.5) pendant 1 heure à température ambiante. et incubé pendant une nuit à 4 ° C avec un anticorps primaire anti-HTT (clone 1HU-4C8) ou anti-GAPDH (clone 6C5) (tableau supplémentaire 2). Les membranes ont ensuite été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à une peroxydase, dilués dans du lait 1% dans du TBST. Le réactif chimioluminescent Pico SuperSignal West (Thermo Scientific, cat. 34078) a été utilisé pour incuber les membranes et les images ont été acquises numériquement par ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare). Les gels non recadrés et les valeurs numériques sont fournis dans le fichier de données source.

Les souris ont été sacrifiées par dislocation cervicale et les tissus ont été homogénéisés dans un tampon de lyse contenant 20 mM de Tris-HCl, pH 7.4, 1 % de Nonidet P-40, 1 mM d'EDTA, 20 mM de NaF, 2 mM de Na.₃VO₄ et mélange d'inhibiteurs de protéase 1:1000 (Sigma-Aldrich) et soniqué. Pour l'expérience dans la Fig. 1b, 50 µg de lysat de protéines totales de souris WT, de souris R6/2, de cellules Q15 et de cellules Q128 ont été chargés dans un gel d'empilement d'acrylamide 5-11 % coulé à la main et incubés avec les anticorps suivants : anti-HTT (clone EM48) et anti -GAPDH (Tableau Complémentaire 2). Pour les expériences de la Fig. 8a, d, e et g, 40 µg de lysat protéique total ont été immunoblottés avec les anticorps suivants : anti-GFP, anti-ACTIN (clone 8H10D10), anti-HTT (clone EM48), anti-TUBULIN (clone B-5-1-2) (Tableau supplémentaire 2). Les membranes ont été traitées comme décrit ci-dessus. Les images ont été acquises numériquement par VWR Imager CHEMI Premium ou ChemiDoc XRS+ (n° de modèle : Universal Hood II) avec Image Lab Software, BioRad (v. 6.1). La quantification a été effectuée à l'aide de Fiji 2.9.0 avec soustraction de fond et normalisation sur le contrôle de chargement (GAPDH, ACTIN ou TUBULIN). Les gels non recadrés sont fournis dans les fichiers de données source.

Immunofluorescence

L'immunofluorescence pour la détection de MTF1 dans les CSE de souris a été réalisée sur des cellules étalées sur des lamelles de verre revêtues de fibronectine (Merck, cat. FC010). Les cellules ont été fixées dans du formaldéhyde 4% (Sigma-Aldrich, cat. F8775) dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante, lavées dans du PBS, perméabilisées pendant 10 minutes dans du PBS + 0.1% Triton X-100 (PBST) à température ambiante et bloquées dans du PBST + 3% de sérum de cheval (HS ; Gibco, cat. 16050-122) pendant 45 minutes à température ambiante. Les cellules ont été incubées pendant une nuit à 4 ° C avec des anticorps primaires (pour les détails des anticorps primaires et secondaires, voir le tableau supplémentaire 2) en PBST + 3% de HS. Après lavage au PBST, les cellules ont été incubées avec des anticorps secondaires (Alexa, Life Technologies) pendant 45 minutes à température ambiante. Les noyaux ont été colorés au DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole; Sigma-Aldrich, cat. F6057). Les images ont été acquises avec des microscopes confocaux Leica SP5. L'analyse d'image a été effectuée à l'aide de Fidji 2.9.0. La quantification de l'intensité nucléaire et cytoplasmique a été réalisée avec le logiciel CellProfiler (v4.1.3). En bref, les noyaux ont été détectés par coloration au DAPI. Le cytoplasme a été arbitrairement défini par des noyaux en expansion radiale de 10 pixels. Le rapport de l'intensité nucléaire intégrée du signal MTF1 sur l'intensité intégrée cellulaire du signal MTF1 (noyau + cytoplasme) a été calculé et tracé.

L'analyse d'immunofluorescence sur les CSPi et les PNJ humains a été réalisée sur des lamelles de verre revêtues de Matrigel à 1 % dans des puits. Les cellules ont été fixées dans du formaldéhyde 4% (Sigma-Aldrich, cat. F8775) dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante, lavées dans du PBS, perméabilisées pendant 1 heure dans du PBST à température ambiante et bloquées dans du PBST + 5% de HS (Gibco, réf. 16050-122) pendant 5 heures à température ambiante. Les cellules ont été incubées pendant une nuit à 4 ° C avec des anticorps primaires (pour les détails des anticorps primaires et secondaires, voir le tableau supplémentaire 2) en PBST + 3% de HS. Après lavage avec du PBS, les cellules ont été incubées avec des anticorps secondaires (Alexa, Life Technologies) pendant 45 minutes à température ambiante. Les noyaux ont été colorés au DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole; Sigma-Aldrich, cat. F6057). Les images ont été acquises avec des microscopes confocaux Zeiss LSM900 Airyscan 2. L'analyse d'image a été effectuée à l'aide de Fidji 2.9.0.

Isolement d'ARN, transcription inverse et PCR quantitative

Pour le lysat cellulaire, l'ARN a été isolé à l'aide du kit de purification d'ARN total (Norgen Biotek, cat. 37500) et l'ADN complémentaire (ADNc) a été fabriqué à partir de 500 ng à l'aide de la transcriptase inverse M-MLV (Invitrogen, cat. 28025-013), RNaseOUT (40 unités/µL), amorces aléatoires (200 nM), dNTP (10 mM), First-Strand Buffer 5x, DTT (0.1 M). Pour les larves de poisson zèbre, l'ARN total a été isolé en profitant de l'extraction au phénol-chloroforme. L'ARN total a été isolé à partir de pools de 10 animaux en utilisant le réactif TRIzol (Life Technologies, cat. 15596026), en suivant les instructions du fabricant pour la procédure d'extraction standard au trizol-chloroforme-éthanol. Le glycogène sans RNase a été utilisé comme suggéré par le protocole, pour augmenter le rendement de l'étape de précipitation de l'ARN. 2 µg d'ARN total ont été rétrotranscrits en ADNc en utilisant la Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, cat. 18080044) et un mélange d'amorces oligo(dT)18 (500 µg/mL) ; mélange de dNTP (10 mM); TNT (0.1 M) ; 5x tampon premier brin ; RNaseOUT (40 unités/μL).

Pour la PCR en temps réel, le mélange SYBR Green Master (Bioline, cat. BIO-94020) a été utilisé. Les amorces sont détaillées dans le tableau supplémentaire 3. Des répétitions techniques ont été réalisées pour toutes les PCR quantitatives. Pour les ESC de souris, les iPSC et les PNJ humains, Gapdh et GAPDH ont été utilisés comme contrôle endogène pour normaliser l'expression. La moyenne Ct du poisson zèbre gapdh, eef1a1l1, tuba1b ainsi que b2m a été utilisé comme contrôle interne endogène pour la normalisation, en raison de la variabilité montrée en regardant les niveaux d'expression de ces gènes. Les données qPCR ont été acquises avec les versions 6 et 7 du logiciel QuantStudio™ 1.0&1.3 Flex.

Séquençage d'ARN : préparation de la bibliothèque

L'ARN total a été quantifié à l'aide du dosage fluorimétrique Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Les bibliothèques ont été préparées à partir de 125 ng d'ARN total à l'aide du service de séquençage de qualité recherche NEGEDIA Digital mRNA-seq (Negedia srl)¹⁴⁰ qui comprenait la préparation de la bibliothèque, l'évaluation de la qualité et le séquençage sur un système de séquençage NovaSeq 6000 utilisant une stratégie à extrémité unique de 100 cycles (Illumina Inc.).

Flux de travail bioinformatique

Les données brutes ont été analysées par le pipeline NEGEDIA Digital mRNA-seq propriétaire de Next Generation Diagnostics srl, qui implique une étape de nettoyage par filtrage et ajustement de qualité, alignement sur le génome de référence et comptage par gène.^142,143. Les gènes ont été triés en supprimant ceux qui avaient un nombre total de comptes inférieur à 5 dans au moins 3 échantillons sur 30. Après avoir appliqué ce filtre, nous avons identifié 11,851 XNUMX gènes exprimés qui ont été pris en compte pour d'autres analyses.

L'analyse de l'expression différentielle a été réalisée dans l'environnement R (v. 4.1.0) avec Bioconductor (v. 3.14) exploitant le package DESeq2 R. (version 1.34.0)¹⁴⁴ et bordR (v. 3.36.0)¹⁴⁵. DESeq2 effectue l'estimation des facteurs de taille, l'estimation de la dispersion pour chaque gène et ajuste un modèle linéaire généralisé binomial négatif avec des statistiques de Wald bilatérales. Signification biologique des DEG entre Q128 et Q15 (Fig. 1g), des DEG entre Q128_Mtf1 et Q128 (Fig. 5b) et de gènes sauvés par Mtf1 (Figue. 5c) a été exploré par l'analyse d'enrichissement des termes Gene Ontology (GO) à l'aide du logiciel Enrichr (v. 3.0) et incluant les catégories de processus biologiques (BP) (2021) et de fonction moléculaire (MF) (2021).

Pour effectuer l'enrichissement de la prolifération des populations cellulaires (GO:0008283 et¹⁴⁶) et les signatures géniques d'apoptose (R-HSA-109581 et WP1351) dans les lignées cellulaires Q128 et Q15 surexprimant Mtf1, nous avons utilisé le logiciel Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) (v 4.3.2)¹⁴⁷. Des listes d'ensembles de gènes pré-classés ont été générées sur la base du journal₂ valeurs de changement de pli (FC) telles qu'obtenues par l'analyse de l'expression différentielle entre Q128_Mtf1 vs Q128 et Q15_Mtf1 vs Q15.

L'analyse d'enrichissement de motifs a été réalisée à l'aide de l'outil Motif Analysis de la suite Regulatory Genomics Toolbox (https://reg-gen.readthedocs.io). Mtf1 MRE a été obtenu à partir de la base de données Jaspar (9ème version, http://jaspar.genereg.net/)¹⁴⁸. La commande « rgt-motifanalysis matching » a été utilisée pour rechercher des sites de liaison sur la région promotrice de tous les gènes d'intérêt ; ensuite, "l'enrichissement de rgt-motifanalysis" a été utilisé pour effectuer un test exact de Fisher pour évaluer si la proportion de sites de liaison dans l'ensemble de gènes d'intérêt est plus élevée que prévu par hasard.

Un réplicat biologique représentatif des données de séquençage d'ARN et Mtf1 MRE ont été visualisés sous forme de pistes dans le visualiseur de génomique intégré (IGV v. 2.16.0) et illustrés à la Fig. 5h.

Des parcelles volcaniques et des diagrammes de dispersion ont été produits avec log₂ FC et -log₁₀ p-value exploitant la fonction ggscatter du package ggpubr R (v. 0.4.0.5). Les cartes thermiques ont été créées à l'aide des valeurs CPM avec la fonction pheatmap du package pheatmap R (v. 1.0.12).

Alignement des orthologues Mtf1

La Mtf1 l'alignement des séquences a été réalisé à l'aide du logiciel Clustal Omega (v1.2.4, https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)¹⁴⁹. L'identité entre les séquences a été calculée à l'aide du programme Sequence Manipulation Suite (https://www.bioinformatics.org/sms2/ident_sim.html).

Analyse des métaux

Après un traitement de conditionnement de 48 heures, 10⁷ Les cellules Q15 et Q128 ont été collectées, centrifugées dans des tubes Eppendorf, le surnageant a été éliminé et les culots cellulaires ont été stockés à -80 °C. Immédiatement avant l'analyse, les cellules ont été décongelées et remises en suspension dans du HNO concentré₃ (68 %), 1 ml ajouté à chaque échantillon. Après dissolution complète, nous avons ajouté 2 ml d'eau ultrapure et complètement minéralisé l'échantillon au moyen d'un chauffage par micro-ondes, à l'aide d'un réacteur micro-ondes haute pression à haut rendement (Ultrawave, Milestone, Bergame, Italie). La même procédure a été appliquée au milieu de culture, avant et après le traitement de conditionnement. Les courbes d'étalonnage pour la quantification des métaux ont été obtenues en préparant six solutions étalons à différentes concentrations (0.005-0.010-0.025-0.050-0.100-0.200 ppm), en utilisant des étalons multi-éléments et mono-éléments certifiés (Agilent). Tous les échantillons ont ensuite été filtrés à travers un filtre seringue de 0.20 µm. L'analyse des métaux, avec l'atomisation et l'ionisation des échantillons obtenus dans un plasma d'Argon, a été réalisée par Inductively Coupled Plasma - Optical Emission Spectrometry (ICP-OES, mod 5110, Agilent).

Génération du modèle Zebrafish HD

Le poisson zèbre HD a été généré par microinjection dans des embryons au stade unicellulaire d'ARNm codant pour le premier exon de l'homme HTT y compris 74Q ou 16Q, fusionné dans le cadre à la séquence de codage eGFP. Q74eGFP et Q16eGFP ont été clonés dans le plasmide pCS2+ afin de permettre la transcription in vitro. Les plasmides pCS2_Mtf1 et pCS2_mCherry ont également été générés pour obtenir Mtf1 ainsi que mCherry ARNm utilisés pour les injections dans les embryons HD de poisson zèbre.

Pour la transcription in vitro de l'ARN, 2.5, 2 μg de pCS74_Q2eGFP, pCS16_Q2eGFP, pCS1_Mtf2 et pCS37_mCherry ont été linéarisés par digestion pendant la nuit à 3189 ° C avec HF-Not I (New England Biolabs, cat. R4003S). Le volume de digestion a ensuite été concentré par le kit DNA Clean & Concentrator (Zymo Research, cat. D6) et utilisé pour la réaction de transcription coiffée (mMESSAGE mMACHINETM SP1340 Transcription Kit, Thermo Fisher Scientific, cat. AM6) par l'ARN polymérase SP2238. Après avoir retiré la matrice d'ADN par traitement à la DNase (Thermo Fisher Scientific, cat. AM15) pendant 37 minutes à 1000 ° C, l'ARN a été purifié par extraction au phénol-chloroforme (comme indiqué dans le paragraphe « Isolement de l'ARN, transcription inverse et PCR quantitative »). L'ARN a été quantifié par Nanodrop ND-10 puis dilué selon les besoins dans un mélange de tampon Danieau 8% [NaCl 0.7 mM, KCl 0.4 mM, MgSO XNUMX mM₄, 0.6 mM Ca(NO₃)₂, HEPES 2.5 mM, pH 7.6], 10 % de rouge de phénol (Merck, cat. 1072410025) et de l'eau sans RNase.

Afin de sélectionner la dose d'injection qui a causé le taux le plus élevé de malformations avec le taux de mortalité le plus bas, nous avons injecté des doses croissantes d'ARNm Q74eGFP allant de 150 à 1000 pg/embryon et avons noté phénotypiquement 24 embryons hpf. Une fois établie la dose de 250 pg/embryon, sous un microscope optique, les embryons ont été injectés avec des ARNm transcrits in vitro. Les embryons microinjectés ont ensuite été transférés dans de l'eau de poisson et incubés à 28 °C. Les œufs non fécondés ont été reconnus et jetés 4 heures après la microinjection. 24 têtards hpf ont été déchorionés à l'aide d'aiguilles dédiées sous un microscope optique.

Colorations complètes

Les embryons injectés ont été anesthésiés avec de la tricaïne et immobilisés dans 1.5 % de méthylcellulose ou 2 % d'agarose à bas point de fusion et analysés à l'aide d'un microscope à fluorescence Leica M165FC. Les images confocales de poisson zèbre ont été acquises avec un microscope confocal Nikon C2 H600L.

Pour la coloration in vivo au sel d'acridine orange hemi (chlorure de zinc) (Merck, cat. A6014), 24 embryons hpf ont été déchorionés, transférés dans une plaque à 6 puits et incubés dans environ 2 ml d'acridine orange (20 μg / ml) par puits dans de l'eau de poisson pendant 15 minutes à 28 °C. La solution d'acridine a ensuite été retirée et les embryons ont été lavés trois fois avec 1 ml d'eau de poisson. Avant d'être observés sur lame de verre par un microscope à fluorescence, les têtards ont été anesthésiés par la Tricaïne.

Pour le test TUNEL, le kit de détection d'apoptose ApopTag Fluorescein In Situ (Merck, cat. S7110) et la collagénase (Merck, cat. C9891) ont été utilisés. 7 embryons à 30 heures post-microinjection par condition ont été placés dans un Eppendorf, anesthésiés avec de la tricaïne et fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) à 4 ° C pendant la nuit. Ensuite, le PFA a été retiré et les échantillons ont été lavés avec du PBS (3 fois, 10 minutes chacun), tout en secouant. Les embryons ont été déshydratés à travers une série de solutions de méthanol allant de 10% à 100% et congelés à -20 ° C pendant la nuit. Ensuite, les embryons ont été réhydratés avec une série de solutions de méthanol à 70-50-30% et lavés avec du PBS avec du Tween-20 pendant 10 minutes, tout en agitant. Après cela, la collagénase a été appliquée pendant 8 minutes tout en secouant et l'excès a été lavé avec du PBS avec des étapes de lavage au Tween-20 (3 fois, 5 minutes chacune). Les échantillons ont été incubés pendant 1 heure dans le tampon d'équilibrage sous agitation, puis pendant 2 heures à 37 °C dans du TdT de force de travail. La réaction a été stoppée en lavant deux fois les échantillons dans le tampon Stop/Wash de la force de travail. Ensuite, il y a eu une étape de blocage d'une heure avec du PBS avec du Tween-1 sous agitation, puis les embryons ont été incubés pendant une nuit dans une solution de conjugué anti-digoxigénine Working Strength à 20 ° C dans l'obscurité. Le lendemain matin, la solution d'anticorps a été retirée, les échantillons ont été lavés avec du PBS (4 fois, 4 minutes chacun) et analysés au microscope confocal. Les structures antérieures des larves de poisson zèbre ont été scannées en 10 piles de 70 μm chacune, couvrant toute leur profondeur. Nous avons quantifié les fractions de la zone fluorescente positive sur la surface totale (à l'exclusion de la région du jaune). Pour les analyses de quantification, toutes les images ont été acquises avec les mêmes paramètres d'exposition et traitées à l'aide du logiciel Fiji (v3.475). Des analyses statistiques ont été effectuées avec Past (v.2.9.0) et Prism (v.4.03).

Injection de vecteur AAV-PHP.eB, phénotypage de souris et collecte de tissus

Des particules virales AAV-PHP.eB ont été produites et titrées dans le laboratoire de Broccoli comme décrit précédemment⁷⁵. Ce vecteur viral a été modifié pour exprimer sous le contrôle du promoteur Ef-1ɑ le gène candidat Mtf1 ou soit eGFP comme contrôle. L'injection vasculaire a été réalisée dans un dispositif de contention qui positionnait la queue dans une rainure chauffée. La queue a été tamponnée avec de l'alcool puis injectée par voie intraveineuse. Des souris WT et R6/2 ont été randomisées en groupes et injectées dans la veine caudale à l'âge de 4.2 semaines. Après l'injection, toutes les souris ont été pesées deux fois par semaine. Un phénotypage a été effectué, en aveugle au génotype et au traitement, deux fois par semaine. L'équilibre et la coordination motrice ont été évalués par le test Rotarod et Horizontal Ladder Task. L'ADN total a été isolé à partir de tissus animaux (cortex et striatum) à l'aide des kits Qiagen DNeasy Blood and Tissue (QIAGEN, cat. 9504).

Élevage

Toutes les expériences sur le poisson zèbre ont été réalisées à la Fish Facility du Département de biologie de l'Université de Padoue. Les larves de poisson zèbre ont été conservées au maximum trois jours dans des boîtes de Pétri avec de l'eau de poisson (60 mg d'Instant Ocean, cat. SS15-10, par litre d'eau distillée) à pH neutre à 28 °C, selon les procédures standard (http://ZFIN.org).

Des colonies de souris ont été établies à l'IRCCS Neuromed. Couples reproducteurs de la lignée R6/2 de souris femelles transgéniques [nom de la souche : B6CBA-tgN (HDexon1) 62Gpb/1 J] avec ~160 ± 10 expansions répétées CAG ont été achetées auprès des Jackson Laboratories. Les souris ont été hébergées dans des conditions standard (22 ± 1 °C, 60 % d'humidité relative, horaire clair/obscur de 12 h, 3 à 4 souris/cage, avec libre accès à la nourriture et à l'eau). Des souris mâles R6/2 (âgées de 5 à 6 semaines) ont été croisées avec des souris femelles B6CBA WT (âgées de 5 à 6 semaines) pour le maintien de la colonie ; les souris WT et R6/2 résultantes ont été utilisées pour toutes les expériences réalisées dans cette étude. Une liste complète des souris utilisées dans cette étude, indiquant l'âge, le sexe, les traitements et les mesures, est rapportée dans le tableau supplémentaire 4. Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le comité d'éthique de l'IRCCS Neuromed Animal Care Review Board et par l'Istituto Superiore di Sanità (numéro de permis ISS : 548/2022-PR) et ont été menées conformément à la directive 2010/63/UE relative aux expérimentations animales.

Tests de comportement moteur

Tous les tests de comportement ont été effectués pendant la phase claire du cycle lumière/obscurité. Les souris ont été testées avant et après le traitement aux moments indiqués. Avant la formation et les tests, les souris ont subi une période d'accoutumance à la salle de test et à l'équipement. Toutes les souris ont reçu une formation pendant deux jours consécutifs sur chaque instrument et tâche avant d'effectuer des mesures de comportement moteur. Les souris ont été testées à vitesse fixe (0.1 rcf) sur un appareil rotatif pendant 1 min. Chaque souris a été testée dans trois essais consécutifs de 1 min chacun, avec 1 min de repos entre les essais. Le temps passé sur le rotarod dans chacun des trois essais a été moyenné pour donner le temps total pour chaque souris. Dans la tâche de l'échelle horizontale, les souris marchaient spontanément le long d'une échelle horizontale avec un espacement variable et irrégulier entre les échelons. Lors de chaque session de test, les performances de la souris ont été évaluées à l'aide d'un système de notation des pas établi¹⁵⁰, qui permet une évaluation qualitative et quantitative du placement des membres antérieurs et postérieurs sur les échelons de l'échelle. Tous les tests moteurs ont été effectués par le même expérimentateur qui a été aveuglé au génotype de la souris et au groupe expérimental tout au long de l'analyse.

Analyse de serrage

Le score de serrage est déterminé sur 30 secondes. En particulier, les souris ont été suspendues par leur queue à une hauteur de 50 cm et une réponse de serrage des membres a été définie comme le retrait de tout membre vers le torse pendant plus de 2 secondes. Les scores suivants ont été utilisés : 0 (absence d'étreinte), 0.5 (retrait d'un seul membre), 1 (retrait de deux membres quelconques), 1.5 (retrait de trois membres quelconques), 2 (retrait des quatre membres).

Dihydroéthidium (DHE)

immunocoloration des agrégats mHTT

Les souris WT et R6/2 ont été sacrifiées par dislocation cervicale. Les cerveaux ont été prélevés et parés en retirant les bulbes olfactifs et la moelle épinière. Le cerveau restant a été traité et inclus dans de la cire de paraffine, des coupes coronales de 10 µm ont été coupées sur un microtome RM 2245 (Leica Microsystems) et flottaient dans un bain-marie à 40 ° C contenant de l'eau distillée. Les coupes ont été transférées sur des lames de verre adaptées à l'immunohistochimie et laissées sécher pendant une nuit à température ambiante. Les échantillons ont été déparaffinés dans du xylène pendant 30 minutes, transférés dans de l'alcool à 100 % pendant 10 minutes, puis une fois dans de l'alcool à 95 %, 70 % et 50 % respectivement pendant 10 minutes chacun, lavés deux fois dans du PBS. Pour démasquer l'épitope antigénique, la récupération de l'antigène a été effectuée en utilisant la méthode du tampon citrate (incuber avec un tampon citrate 10 mM, pH 6.0 à 95-100 ° C pendant 15 minutes puis laisser refroidir les lames pendant 15 minutes). Les lames ont été lavées deux fois avec du PBS, perméabilisées dans du TBS-Triton 0.1 % pendant 10 minutes, puis incubées dans une chambre humidifiée à température ambiante avec un tampon de blocage (sérum de cheval 10 % dans du PBS) pendant 1 h. Le tampon de blocage a été retiré et les lames ont été incubées dans une chambre humidifiée à 4 ° C pendant la nuit à l'aide d'un anticorps anti-HTT de souris (clone EM48, pour plus de détails, voir le tableau supplémentaire 2). Après trois lavages avec du PBS, les cellules ont été incubées avec des anticorps secondaires pendant 1 h dans une chambre humidifiée à température ambiante, à l'abri de la lumière. Les noyaux ont été colorés au DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole; Sigma-Aldrich, cat. F6057). Quatre souris par groupe expérimental ont été utilisées et trois sections coronales pour chaque animal ont été acquises avec le microscope Nikon ECLIPSE Ni et analysées par le logiciel d'image NIS-Elements (v. 4.40, Nikon) et le logiciel Fiji 2.9.0.

Statistiques et reproductibilité

Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille de l'échantillon, mais nos tailles d'échantillon sont similaires à celles couramment utilisées dans notre domaine de recherche. Aucune donnée n'a été exclue des analyses. La distribution des données était supposée normale, mais cela n'a pas été formellement testé. P-valeurs pour des expériences impliquant des mesures répétées (Fig. 1c, Figue. 4f, Figue. 7b (À gauche), 7c (à gauche) et 7g, Figue. 8d,f, Fig. Supplémentaire 1e, Fig. Supplémentaire 4a,c, Fig. Supplémentaire 8c, Fig. Supplémentaire 9c) ont été calculés avec une ANOVA à mesures répétées à deux voies avec correction de Bonferroni. Pour les expériences avec des lignées cellulaires, nous avons attribué au hasard une fraction de chaque population cellulaire à différents réplicats biologiques. Pour l'analyse des données d'immunomarquage et de cytométrie en flux, nous avons analysé des champs aléatoires ou une fraction aléatoire de cellules. Les autres types d'expériences n'étaient pas randomisés. La collecte et l'analyse des données n'ont pas été effectuées à l'aveugle des conditions des expériences, mais les analyses de données ont été effectuées avec des paramètres et des logiciels identiques. L'analyse des comportements moteurs de la souris a été réalisée en aveugle. La représentation des données et les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide des logiciels R (v. 4.0.0 et v. 4.1.0) et PAST (v4.03), sauf indication contraire. Toutes les barres, les barres d'erreur et les boîtes à moustaches sont définies dans les légendes des figures. Le nombre de répétitions biologiques et d'expériences indépendantes, toutes deux > 2, est indiqué dans les légendes des figures. Les tests statistiques utilisés sont indiqués dans les légendes des figures. Toutes les expériences de qPCR ont été réalisées avec trois répétitions techniques. Des résultats expérimentaux clés ont été obtenus par 2 opérateurs indépendants.

Résumé du rapport

De plus amples informations sur le design de la recherche sont disponibles dans Sommaire des rapports sur le portefeuille de la nature lié à cet article.

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La source: https://www.nature.com/articles/s41467-023-39552-9

Le criblage à l'échelle du génome dans des cellules pluripotentes identifie Mtf1 comme un suppresseur de la toxicité de la huntingtine mutante - Nature Communications