Des échafaudages d'origami d'ADN portant des gènes ont été préparés comme décrit précédemment²⁴, résumé comme suit.

PCR standard

Les amorces pour l'amplification du gène de la protéine fluorescente verte (GFP) ont été conçues à l'aide de SnapGene et achetées auprès d'Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA, USA). La séquence de chaque amorce est répertoriée dans le tableau supplémentaire 1. La polymérase Phusion® pour la réaction PCR a été achetée auprès de New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA).

Pour la génération d'un gène duplex contenant tous les composants pour la transcription, chaque mélange de réaction PCR a été préparé dans un volume final de 50 µL, composé de 1 × tampon Phusion® HF (NEB), mélange de dNTP 200 nM (NEB), amorce sens 500 nM ( T7EGFP sens = brin sens indésirable), amorce antisens 500 nM (T7EGFP anti = brin antisens souhaité), 10 ng de matrice plasmidique (pCMV-T7-EGFP ; Addgene, Watertown, MA, États-Unis), 0.5 µL d'ADN polymérase Phusion® et nucléase -eau libre au volume. Chaque PCR a été réalisée en utilisant les étapes de thermocycleur suivantes : 30 s à 98 °C, 30 s à 58 °C et 1 min à 72 °C pendant 30 cycles²⁴.

Pour la génération de promoteurs manquants du gène duplex, chaque mélange de réaction PCR a été préparé dans un volume final de 50 µL, composé de 1 × tampon Phusion® HF (NEB), mélange de dNTP 200 nM (NEB), amorce sens 500 nM (RT-sens) , 500 nM d'amorce antisens (T7EGFP anti), 10 ng de pCMV-T7-EGFP (Addgene), 0.5 µL d'ADN polymérase Phusion® et de l'eau sans nucléase au volume. Chaque PCR a été réalisée en utilisant les étapes de thermocycleur suivantes : 30 s à 98 °C, 30 s à 59 °C et 1 min à 72 °C pendant 30 cycles²⁴.

Les produits de la réaction ont été mélangés avec 6 × colorant de charge (15 % Ficoll®-400, 60 mM EDTA, 19.8 mM Tris–HCl, 0.48 % SDS, 0.12 % colorant 1, 0.006 % colorant 2, pH 8 à 25 °C ; NEB ) puis chargé sur un gel d'agarose à 1% pré-coloré avec un colorant ADN sûr SYBR (Invitrogen, Waltham, MA, USA). L'électrophorèse a été réalisée à 8 V/cm pendant 1 h. L'ADN contenant SYBR Safe a été visualisé à l'aide d'un transilluminateur de longueur d'onde de 490 nm (bleu) et d'un filtre ambré²⁴.

PCR asymétrique (aPCR)

Les amorces utilisées dans l'aPCR étaient identiques à celles utilisées dans la PCR standard. En plus des amorces sens et antisens, une amorce modifiée terminale 3' (bloqueur T3EGFP 7') a été utilisée. Le bloqueur 3' T7EGFP a été conçu à l'aide de SnapGene et acheté auprès d'IDT. Sa séquence est répertoriée dans le tableau supplémentaire 1.

Pour la génération d'un échafaudage contenant tous les composants pour la transcription, chaque réaction aPCR a été réalisée dans un volume total de 50 µL, composé de 1 × tampon LongAmp® Taq (60 mM Tris-SO₄, 20 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 3 % glycérol, 0.06 % IGEPAL® CA-630, 0.05 % Tween® 20, pH 9.1 à 25 °C) de NEB, 500 nM T7EGFP anti, 25 nM T7EGFP sense, 475 nM 3' T7EGFP blocker, 300 nM dNTP mix de NEB, 10 ng de gène GFP double brin (dsT7EGFP ; généré par PCR standard), 2 µL d'ADN polymérase LongAmp® Taq (NEB) et de l'eau sans nucléase jusqu'au volume final. Chaque aPCR a été réalisée en utilisant les étapes de thermocycleur suivantes : 30 s à 94 °C, 30 s à 58 °C et 2 min à 65 °C pendant 25 cycles²⁴.

Pour la génération d'un échafaudage contenant tous les composants pour la transcription à l'exception de l'élément promoteur, chaque réaction PCR a été réalisée dans un volume total de 50 µL, composé de 1 × tampon LongAmp® Taq (60 mM Tris-SO₄, 20 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 3 % glycérol, 0.06 % IGEPAL® CA-630, 0.05 % Tween® 20, pH 9.1 à 25 °C) de NEB, 1 µM T7EGFP anti, 20 nM RT sense, 300 nM dNTP mix de NEB, 10 ng double- gène GFP brin dépourvu de promoteurs (dsT7EGFP -T7 ; généré par PCR standard), 2 µL LongAmp® Taq ADN polymérase (NEB) et eau sans nucléase jusqu'au volume final Chaque aPCR a été réalisée en utilisant les étapes de thermocycleur suivantes : 30 s à 94 °C, 30 s à 59 °C et 2 min à 65 °C pendant 25 cycles²⁴.

Le produit de réaction a été chargé sur un gel d'agarose à 1% pré-coloré avec 1 × SYBR Safe (Invitrogen), soumis à une électrophorèse et visualisé comme ci-dessus.

Purification d'ADN double brin (ADNdb)

Un kit de récupération d'ADN Zymoclean Gel (Zymo Research, Irvine, CA, USA) a été utilisé pour extraire l'ADNdb des gels d'agarose. Les bandes de gel contenant l'ADNdb cible ont été éliminées à l'aide d'une lame de rasoir propre. Trois fois le volume de tranche de gel du tampon de dissolution/liaison d'agarose fourni a été ajouté à chaque fragment de gel et incubé à 55 °C sur un bloc chauffant pendant 15 min. Chaque solution de gel dissous a été transférée dans une colonne de centrifugation à base de silice fournie et centrifugée à une force centrifuge relative (rcf) de 10,000 60 pendant 200 s dans une centrifugeuse de table. 10,000 µL de tampon de lavage d'ADN à base d'éthanol ont été ajoutés à chaque colonne de centrifugation et centrifugés à 30 10,000 rcf pendant 60 s. Une étape de lavage a été répétée avant centrifugation à 6 20 rcf pendant 10 s pour l'élimination complète de l'éthanol. L'écoulement de toutes les étapes a été rejeté. Après avoir transféré chaque colonne de centrifugation dans un tube de microcentrifugeuse propre, 0.1 à 8.5 µL du tampon d'élution fourni (Tris-HCl 10,000 mM, EDTA 60 mM, pH 6) ont été ajoutés directement à la matrice de chaque colonne de centrifugation suivie d'une centrifugation à 1 1 rcf pendant 8 s pour la collecte d'ADN. Une fraction de chaque ADNdb purifié a été mélangée avec 1 × colorant de charge (NEB) et chargée sur un gel d'agarose à 19.1 % pré-coloré avec XNUMX × SYBR safe (Invitrogen). Le gel a fonctionné à XNUMX V/cm pendant XNUMX h. Le rendement de l'échantillon d'ADNdb purifié a été évalué en mesurant les intensités de bande par rapport à un contrôle connu à l'aide de GelAnalyzer XNUMX disponible sur www.gelanalyzer.com (consulté le 19 août 2021)²⁴.

Purification simple brin (ssDNA)

Un kit de récupération d'ARN sur gel Zymoclean de Zymo Research a été utilisé pour purifier l'ADNss à partir de gels d'agarose. Les bandes de gel contenant l'ADNss cible ont été excisées avec une lame de rasoir propre. Trois fois le volume de la tranche de gel du tampon de dissolution/liaison d'agarose fourni a été ajouté à chaque bande de gel excisée et fondu à 55 °C sur un bloc chauffant pendant 15 min. Chaque solution de gel dissous a été transférée dans une colonne de centrifugation à base de silice fournie et centrifugée à 12,000 2 rcf pendant 400 min. 12,000 µL de tampon RNA Prep ont été ajoutés à chaque colonne de centrifugation, suivis d'une centrifugation à 1 800 rcf pendant 12,000 min. Le lavage a été effectué par l'ajout de 30 µL de tampon de lavage à base d'éthanol suivi d'une centrifugation à 400 12,000 rcf pendant 2 s. Après avoir répété l'étape de lavage avec 6 µL de tampon de lavage à base d'éthanol, chaque colonne de centrifugation a été centrifugée à 20 10,000 rcf pendant 1 min pour éliminer l'éthanol résiduel. L'écoulement à toutes les étapes a été rejeté. Après avoir transféré chaque colonne de centrifugation dans des tubes de microcentrifugeuse propres, 6 à XNUMX µL d'eau sans nucléase fournie ont été ajoutés directement à la matrice de la colonne, et les colonnes de centrifugation ont été centrifugées à XNUMX XNUMX rcf pendant XNUMX min pour la collecte du rétentat. Une fraction de chaque ADNss purifié a été mélangée avec XNUMX × colorant de charge (NEB) et le rendement a été estimé par électrophorèse sur gel comme décrit ci-dessus²⁴.

Construction de nanoparticules d'ADN

Les nanoparticules d'ADN ont été conçues à l'aide de caDNAno (www.cadnano.org) et les agrafes ont été achetées auprès d'IDT (tableaux supplémentaires 2 ainsi que 3). Des nanoparticules d'ADN ont été préparées en mélangeant le gène GFP simple brin (ssT7EGFP ou ssT7EGFP -T7; généré par aPCR) à une concentration finale de 91.4 nM et chaque agrafe à une concentration finale de 457 nM dans un tampon 1 × TAE additionné de 12.5 mM Mg( OAc)₂ (TAEM) dans un volume final de 50 µL. L'ensemble d'agrafes pour chaque nanoparticule d'ADN est répertorié dans le tableau supplémentaire 4. Le mélange a été incubé à 90°C pendant 10 min dans un bain-marie suivi d'un refroidissement progressif à température ambiante. Les produits de cette réaction ont été mélangés avec 6 × colorant de charge (NEB), puis chargés sur un gel d'agarose à 1 % contenant 12.5 mM de Mg (OAc)₂ pré-coloré avec 1 × colorant ADN SYBR Safe (Invitrogen). L'électrophorèse a été réalisée dans du tampon TAEM à 6 V/cm pendant 90 min. Le gel a été visualisé comme ci-dessus. L'origami d'ADN a été purifié à l'aide d'une colonne d'extraction de gel d'ADN Freeze 'N Squeeze™ (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Les bandes de gel contenant l'origami d'ADN cible ont été tranchées et retirées à l'aide d'une lame de rasoir propre, puis transférées sur des colonnes Freeze 'N Squeeze™ DNA Gel Extraction Spin. Les colonnes de centrifugation contenant des tranches de gel d'origami d'ADN cible ont été incubées à -20 ° C pendant 5 min, suivies d'une centrifugation à 13,000 3 rcf dans une centrifugeuse de table pendant XNUMX min à température ambiante. La concentration des échantillons d'origami d'ADN purifié a été mesurée à l'aide d'un instrument NanoDrop™.

Transcription in vitro (IVT)

Toutes les réactions IVT ont été réalisées dans un volume total de 20 µL à l'aide d'un kit de synthèse d'ARN HiScribe® T7 Quick High Yield RNA Synthesis (NEB). Chaque réaction contenait 10 µL de mélange tampon NTP (10 mM chaque NTP ; NEB), 10 ng de matrice d'ADN (plasmide GFP linéarisé (LpCMV-T7-EGFP), dsT7EGFP, ssT7EGFP, chaque nanoparticule d'ADN (désignée comme décrit dans le tableau 1 ci-dessous et dans la légende de la Fig. 2b), 2 µL de mélange d'ARN polymérase T7 et d'eau sans nucléase au volume. Chaque réaction a été réalisée à 37°C pendant 2h. Pour T7GHL FS, T7GHL PO et T7GHL HS, un temps de réaction de 30, 60, 90 et 120 min a été effectué pour une comparaison préliminaire des taux de transcription relatifs de ces constructions et de la longévité du substrat.

Purification des produits IVT

Après IVT, 30 µL d'eau sans nucléase ont été ajoutés à chaque produit de réaction IVT pour augmenter le volume de réaction. Chaque produit IVT a ensuite été purifié à l'aide d'un kit de nettoyage d'ARN Monarch® (NEB). 100 µL de tampon de liaison d'ARN ont été ajoutés à chaque 50 µL de produit IVT suivi de l'ajout de 150 µL d'éthanol absolu. Chaque mélange a ensuite été transféré dans une colonne de centrifugation à base de silice fournie et centrifugé dans une centrifugeuse de table. 500 µL de tampon de lavage d'ADN à base d'éthanol ont été ajoutés à chaque colonne de centrifugation et centrifugés comme ci-dessus. L'étape de lavage a été répétée une fois de plus et l'écoulement de toutes les étapes a été jeté. Chaque colonne de centrifugation a été transférée dans un tube de microcentrifugeuse propre et 10 µL de l'eau sans nucléase fournie ont été ajoutés directement à la matrice de chaque colonne de centrifugation, suivis d'une centrifugation pour la collecte d'ADN. Toutes les étapes de centrifugation ont été réalisées dans 16,000 60 rcf pendant XNUMX s.

Évaluation des produits IVT

Les produits IVT de tous les échantillons d'ADN ont été analysés par électrophorèse sur gel. Les produits purifiés de PCR GFP et de plasmide GFP IVT linéarisés ont été dilués 100 fois pour éviter une coloration excessive. Les produits d'ARN purifiés ont été mélangés avec un volume égal de colorant de chargement d'ARN 2 × (formamide 95 %, SDS 0.02 %, bleu de bromophénol 0.02 %, cyanol xylène 0.01 %, EDTA 1 mM ; NEB). Les échantillons ont été chauffés à 70°C pendant 10 minutes avant le chargement du gel. L'électrophorèse a été réalisée à 8 V/cm pendant 1 h. Les gels ont été post-colorés avec une solution 1 × TAE contenant 1 × SYBR gold (Invitrogen) pendant 2 h. Les gels colorés ont été visualisés à l'aide d'un transilluminateur de longueur d'onde de 490 nm et d'un filtre ambré.

PCR de transcription inverse (RT-PCR)

Des matrices d'ARN pour RT-PCR ont été préparées en effectuant une réaction IVT en utilisant chaque matrice d'ADN (LpCMV-T7-EGFP, dsT7EGFP, ssT7EGFP, T7GHL PO, T7GHL HS, T7GHL FS et T7GHL BP) comme décrit ci-dessus. Pour minimiser le signal de fond possible causé par la présence de matrice d'ADN résiduelle, 1 ng de chaque matrice d'ADN (au lieu de 10 ng) a été utilisé pour ces réactions, et le temps d'incubation a été prolongé jusqu'au lendemain pour maximiser la production d'ARN dans ces conditions. Après IVT, l'ADN a été hydrolysé par traitement à la DNase. Un mélange de DNase de 50 µL a été préparé en mélangeant 20 µL de produit IVT avec 2 µL de DNase-I sans RNase et d'eau sans nucléase au volume. Toutes les réactions de DNase ont été effectuées à 37 ° C pendant 30 min. Les produits d'ARN traités à la DNase ont été purifiés à l'aide d'un kit de nettoyage d'ARN Monarch® (NEB) comme décrit ci-dessus. Les amorces pour l'amplification du gène GFP ont été conçues à l'aide de SnapGene et achetées auprès d'IDT. La séquence de chaque amorce est répertoriée dans le tableau supplémentaire 1. La RT-PCR a été réalisée à l'aide d'un kit OneTaq® One-step RT-PCR (NEB). Chaque mélange RT-PCR a été réalisé dans un volume final de 50 µL, contenant 1 × mélange réactionnel Quick-Load® OneTaq One-step (1.6 mM MgCl₂, mélange de dNTP 250 nM), amorce sens 400 nM (RT-sens), amorce antisens 400 nM (RT-anti), 1 µL de chaque produit d'ARN purifié, 1 × mélange d'enzymes OneTaq® One-step (ProtoScript® II reverse transcriptase , ADN polymérase OneTaq® Hot Start, inhibiteur et stabilisateur de RNase murine) et eau sans nucléase au volume. Pour évaluer toute contribution au signal PCR de l'ADN résiduel résultant d'une hydrolyse incomplète de la DNase, des contrôles négatifs ont été préparés en parallèle. Ces réactions contenaient les mêmes composants que les mélanges RT-PCR mais ont remplacé l'ADN polymérase OneTaq® Hot Start par le mélange d'enzymes OneTaq® One-step (c'est-à-dire, totalement dépourvu de transcriptase inverse). Dans ce cas, tout signal représentait l'amplification de l'ADN résiduel restant après le traitement à la DNase. Les réactions ont été réalisées en traitant chaque mélange RT-PCR à 48 ° C pendant 30 min suivi d'une PCR. Chaque PCR a été réalisée en utilisant les étapes de thermocyclage suivantes : 30 s à 94 °C, 30 s à 60 °C et 1 min à 68 °C pendant 15 cycles. Chaque produit a été chargé sur un gel d'agarose à 1 % pré-coloré avec un colorant ADN sans danger pour le SYBR (Invitrogen). Le gel a été soumis à une électrophorèse et visualisé comme ci-dessus.

Microscopie électronique à transmission (MET)

TEM a été effectué comme décrit précédemment²⁵. En bref, des échantillons pour l'imagerie TEM ont été préparés dans une plage de concentration de 0.5 nM à 5 nM. 12 μL de l'échantillon ont été placés sur des grilles TEM en cuivre de 400 mesh revêtues de carbone et à décharge luminescente. Après deux minutes d'incubation, la solution d'échantillon a été retirée à l'aide d'un papier filtre et remplacée par 12 μL de solution de coloration négative au formiate d'uranyle fraîchement préparée. La tache a été enlevée après 30 s et les grilles ont été séchées à l'air. Les images TEM ont été acquises à un grossissement de 25,000 1230 × à l'aide d'un TEM JEOL 2 (Peabody, Ma, USA) équipé d'une caméra Gatan Inc. 2 k × XNUMX k Ultrascan (Pleasanton, CA, USA)²⁵.

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• La source: https://www.nature.com/articles/s41598-023-39777-0