Synthèse de nanobots

Les nanobots ont été préparés comme décrit précédemment³³. En bref, les MSNP ont été synthétisés à l'aide d'une méthode Stöber modifiée⁴¹, en faisant réagir de la triéthanolamine (35 g), de l'eau ultrapure (20 ml) et du bromure d'hexadécyltriméthylammonium (CTAB ; 570 mg) à 95 °C pendant 30 min sous agitation. De l'orthosilicate de tétraéthyle (1.5 ml) a ensuite été ajouté goutte à goutte ; le mélange a été laissé réagir pendant 2 h à 95 °C et les MSNP résultants ont été collectés par centrifugation et lavés dans de l'éthanol (trois fois, 2,500 XNUMXg, 5 min). Pour éliminer la matrice CTAB, les MSNP ont été placées au reflux dans du méthanol acide (1.8 ml de HCl, 30 ml de méthanol) pendant 24 h. Ensuite, les MSNP ont été collectés par centrifugation et lavés trois fois dans de l'éthanol (2,500 XNUMXg, 5 min) avant d'incorporer la modification amine en ajoutant APTES (6 µl par mg de MSNP) aux MSNP (1 mg ml^-1) dans une solution éthanolique à 70% à 70 °C sous agitation vigoureuse pendant 1 h. MSNP-NH₂ ont été collectés et lavés trois fois dans l'éthanol et trois fois dans l'eau par centrifugation (trois fois, 1,150 XNUMXg, 5 min). MSNP-NH₂ ont été remis en suspension dans du PBS à une concentration de 1 mg ml^-1 et un volume total de 900 µl, et activé avec du glutaraldéhyde (100 µl) pendant 2.5 h à température ambiante. Les MSNP-NH activés₂ ont été collectés et lavés dans du PBS trois fois par centrifugation (1,150 XNUMXg, 5 min), remis en suspension dans une solution d'uréase (3 mg ml^-1) et du PEG hétérobifonctionnel (1 μg de PEG par mg de HS-MSNPs-NH de 5 kDa₂) dans du PBS et a réagi pendant 24 h à température ambiante. Les nanobots résultants ont ensuite été collectés et lavés trois fois dans du PBS par centrifugation (1,150 XNUMXg, 5 min) avant de les remettre en suspension dans une dispersion d'AuNPs, préparée comme décrit précédemment⁵¹, en les laissant réagir pendant 10 min, et en les lavant soigneusement par centrifugation (trois fois, 1,150 XNUMXg, 5 minutes).

Distribution de taille hydrodynamique et charge de surface des MSNP, MSNP-NH₂, les nanobots et les nanobots décorés AuNP ont été déterminés à l'aide d'un système de diffusion dynamique de la lumière Wyatt Mobius et d'un Malvern Zetasizer, respectivement. Dans tous les cas, la concentration était de 20 µg ml^-1 et temps d'acquisition 5 s, en utilisant trois analyses par expérience. Trois mesures par type de particule ont été effectuées.

Synthèse des MSNP FITC

Un mélange de FITC (2 mg), d'éthanol (5 ml) et d'APTES (400 µl) a été préparé et agité pendant 30 min. Ensuite, le protocole décrit précédemment pour la synthèse du MSNP a été suivi, sauf que nous avons ajouté goutte à goutte de l'orthosilicate de tétraéthyle (1.25 ml) en combinaison avec le mélange FITC – APTES (250 µl). Les étapes de fonctionnalisation pour obtenir des nanobots marqués au FITC étaient telles que mentionnées ci-dessus.

Synthèse des AuNP

Les AuNP ont été synthétisées à l'aide d'une méthode rapportée³³. En bref, tous les matériaux ont été nettoyés à l’eau régale fraîchement préparée, soigneusement rincés à l’eau et séchés à l’air. Par la suite, un AuCl 1 mM₄ La solution est chauffée jusqu'à son point d'ébullition sous agitation dans un ballon intégré à un système de reflux. Ensuite, 10 ml de solution de citrate de sodium (30.8 mM) ont été ajoutés et la solution a été bouillie pendant 20 min, ce qui a donné une couleur rouge. La solution a ensuite été laissée refroidir à température ambiante sous agitation pendant 1 h. Les AuNP résultants ont été stockés dans l’obscurité et la caractérisation a été réalisée par microscopie électronique à transmission.

Activité enzymatique

Activité enzymatique des nanobots, ¹⁸F-nanobots et ¹³¹Les I-nanobots ont été mesurés à l’aide de rouge de phénol. Pour ce faire, 2 µl de nanobots (1 mg ml^-1) ont été ajoutés à une plaque à 96 puits et mélangés avec 200 µl de différentes solutions d’urée (0, 50, 100, 200 mM) dans 1.1 mM de rouge de phénol. L'absorbance à 560 nm a été mesurée au fil du temps à 37 °C.

Dynamique du mouvement des nanobots grâce à la microscopie optique

Des vidéos optiques de nanobots ont été acquises à l'aide d'un microscope Leica Thunder, couplé à une caméra CCD haute vitesse Hamamatsu et à un objectif ×1.25. Pour cela, les nanobots ont été centrifugés et remis en suspension dans 50 µl de PBS (concentration finale de 20 mg ml^-1). Ensuite, une boîte de Pétri a été remplie de 3 ml de PBS ou d’une solution d’urée à 300 mM (dans du PBS) et observée au microscope. Une goutte de 5 µl avec des nanobots (20 mg ml^-1) a ensuite été ajouté à la boîte de Petri remplie de liquide et des vidéos ont été enregistrées à 25 images par seconde. Les distributions d'intensité des pixels vidéo dans les ROI ont été analysées à intervalles de 15 secondes à l'aide du logiciel ImageJ.

Radiomarquage de nanobots avec [¹⁸F]F-PyTFP

Synthèse de [¹⁸F]F-PyTFP

[¹⁸F] F-PyTFP a été synthétisé dans un module Neptis xSeed (applications radiochimiques optimisées), selon une méthode précédemment rapportée³³.

Synthèse de ¹⁸Nanobots marqués F

Les nanobots ont été étiquetés avec [¹⁸F]F-PyTFP, sur la base d'une procédure préalablement établie avec des modifications mineures³³. En bref, 200 µl de solution nanobot (1 mg ml^-1) a été centrifugé (10 min, 13,853 XNUMXg), remis en suspension dans 10 µl de PBS (1 mM, pH 8), et incubé avec 4 µl de [¹⁸F]F-PyTFP dans de l'acétonitrile (environ 37 MBq) pendant 35 min à température ambiante. Après incubation, le mélange réactionnel a été dilué avec de l'eau (200 µl) et purifié par centrifugation (5 min, 13,853 XNUMXg). Le culot obtenu a ensuite été rincé trois fois avec de l'eau avant d'être mesuré dans un calibrateur de dose (CPCRC-25R, Capintec). Le rendement radiochimique a été calculé comme le rapport entre la quantité de radioactivité présente dans les nanobots après lavage et la quantité initiale de radioactivité. La pureté radiochimique après purification était ≥ 99 %, comme déterminé par radiochromatographie sur couche mince (radio-TLC) en utilisant du papier de chromatographie iTLC-SG (Agilent Technologies) et du dichlorométhane et du méthanol (2 : 1) comme phases stationnaires et mobiles, respectivement. Les plaques TLC ont été analysées à l'aide d'un lecteur TLC (MiniGITA, Raytest).

Stabilité de ¹⁸F-nanobots

La stabilité de ¹⁸Les nanobots marqués au F ont été déterminés à l'aide des milieux suivants : (1) 300 mM d'urée, (2) eau et (3) urine d'animaux porteurs de tumeurs. ¹⁸Des nanobots marqués au F (10 µl) ont été incubés avec la solution correspondante (100 µl) pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, les nanobots et le surnageant ont été séparés par centrifugation et collectés, et la radioactivité a été mesurée dans un calibrateur de dose (CPCRC-25R).

Radiomarquage de nanobots avec ¹³¹I

La radio-iodation des nanobots d'uréase a été réalisée en incubant des nanobots avec des produits injectables [¹³¹Solution I]NaI (925 MBq ml^-1; GE Santé). En bref, 400 µl de solution d'uréase nanobot (1 mg ml^-1) a été centrifugé (13,853 XNUMXg, 5 min), remis en suspension dans 100 µl de PBS (10 mM, pH 7.4) et incubé avec 25 µl ou 185 µl de produit injectable [¹³¹I]NaI (environ 42.55 ou 277.5 MBq, respectivement) pendant 30 min, selon l'activité finale souhaitée. Après incubation, le mélange réactionnel a été purifié par centrifugation (13,853 XNUMXg, 5 min). Le précipité résultant a été lavé trois fois avec de l'eau (100 µl). La radioactivité dans le surnageant et le précipité a été déterminée à l'aide d'un calibrateur de dose (CPCRC-25R), et les deux fractions ont été analysées par radio-CMC, comme pour ¹⁸F-nanobots.

Développement de modèles animaux

Les souris ont été entretenues et manipulées conformément à la directive 2010/63/UE du Conseil européen et aux directives internes. Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le comité d'éthique CIC biomaGUNE et les autorités locales (Diputación Foral de Guipuzcoa, PRO-AE-SS-276). L'analyse des images (TEP et IRM) n'a pas été rendue visible par rapport à la répartition en groupes des animaux.

Le modèle murin orthotopique de cancer de la vessie a été généré par administration intravésicale de cellules MB49 (lignée cellulaire de carcinome murin de la vessie) à des souris femelles C57BL/6JRj (âgées de 8 semaines, Janvier). Pour les expériences visant à déterminer l'accumulation de tumeurs (quatre groupes ; détails ci-dessous), six animaux ont été inoculés par groupe, comme déterminé par analyse de précision, avec les hypothèses suivantes : précision requise, 20 % ; ET attendu, ± 20 % ; confiance, 95%; perte d'animaux, 20%. Pour les expériences d'efficacité thérapeutique (six groupes ; détails ci-dessous), dix animaux ont été inclus par groupe, calculé à l'aide d'un test de Student unilatéral. t-test, différence entre deux moyennes indépendantes, avec les hypothèses suivantes : hypothèse nulle, le traitement n'affecte pas la croissance tumorale ; α, 0.05 ; 1 − β, 0.95 ; sd, ± 50 % ; différences attendues entre les groupes, 50 % ; perte d'animaux, 20%. L'expérience ayant été menée en deux lots pour des raisons opérationnelles, un groupe témoin a été inclus dans les deux lots (tableau 2), puis tous les animaux ont été regroupés. Pour l'établissement de la tumeur, les souris ont été anesthésiées par inhalation d'isoflurane à 3 % dans de l'O pur.₂ et maintenu par 1.0 à 1.5 % d'isoflurane dans 100 % d'O₂. Ensuite, la vessie a été vidée et des lésions chimiques ont été induites sur l'urothélium en instillant par voie intravésicale 50 µl de poly-l-lysine (Sigma-Aldrich) à travers un cathéter de calibre 24 pendant 15 min. Par la suite, la vessie a été à nouveau vidée et les cellules MB49 (10⁵ cellules) dans du DMEM à haute teneur en glucose (100 µl) ont été instillées pendant 1 h avant de retirer le cathéter et de vider la vessie par massage abdominal. Tout au long des expériences, les souris ont été surveillées et pesées pour contrôler leur santé et leur bien-être. Un critère de jugement humain a été appliqué si la perte de poids dépassait 20 % ou sur la base de symptômes cliniques, selon les critères du vétérinaire responsable.

Suivi de la taille de la tumeur

Des études IRM ont été réalisées 7 et 14 jours après l'induction tumorale, à l'aide d'un scanner 7 T Bruker BioSpec USR 70/30 (Bruker BioSpin) équipé d'un insert à gradient BGA-12S de 440 mT m^-1 et un résonateur QSN 112/086 (T12053V3) pour la radiofréquence¹⁴ transmission et une bobine de surface du cerveau de rat (T11205V3) pour la réception RF (toutes deux fonctionnant à 300 MHz). Les animaux ont été anesthésiés à l'isoflurane (4 % pour l'induction et 1.5 % pour le maintien dans une solution à 50 % d'O).₂/50%N₂ mélange) et placé sur un support compatible MR. La température corporelle et la fréquence respiratoire ont été surveillées en permanence à l'aide d'un dispositif de surveillance compatible MR (modèle 1030 SA, Small Animal Instruments), interfacé à un système de chauffage à air pour petits rongeurs pour maintenir la température corporelle. Après avoir acquis des images de référence, une séquence d'imagerie pondérée en diffusion basée sur l'écho de spin a été utilisée pour imager les tumeurs, en utilisant les paramètres suivants : temps d'écho (T_E) = 22.3 ms, temps de répétition (T_R) = 2,500 XNUMX ms, n = 2 moyennes, une image A0 (image basale avec b = 0 s mm^-2) et une image DW acquise en utilisant des gradients de diffusion dans la direction (1, 0, 0) avec une durée de gradient δ = 4.5 ms et une séparation par gradient Δ = 10.6 ms, donnant b = 650 s mm^-2, un 16 × 16 mm² champ de vision, taille de matrice d'image de 160 × 160 points, 20 tranches consécutives de 0.5 mm d'épaisseur (sans espace, acquises en mode entrelacé) et une bande passante de 192.9 Hz par pixel. Pour visualiser les tumeurs, les images ont été post-traitées avec le logiciel ImageJ, en divisant les images acquises avec un gradient de diffusion (b = 650 s mm^-2) par ceux acquis sans (b = 0 s mm^-2), et en appliquant un filtre gaussien 3D (σ_x = σ_y = σ_z = 0.7) au résultat. Les tumeurs ont été délimitées manuellement pour déterminer leur volume.

Biodistribution in vivo

Au jour 15 après l'induction de la tumeur, les souris ont été randomisées en quatre groupes pour obtenir une répartition homogène du volume moyen de la tumeur entre les groupes. Des scanners TEP-CT (scanners MOLECUBES β et X-CUBE) ont été acquis 3 h après l'administration intravésicale de 100 µl de ¹⁸F-BSA (groupes 1 et 2) ou ¹⁸Nanobots F-uréase (groupes 3 et 4) à une concentration de 200 µg ml^-1, en utilisant soit de l'eau (groupes 1 et 3), soit 300 mM d'urée dans l'eau (groupes 2 et 4) comme véhicule (Tableau 1). Pour l'acquisition d'images, les animaux ont été induits sous anesthésie (isoflurane à 5% dans de l'oxygène pur) et placés en position couchée avant de masser la région abdominale pour l'évacuation de la vessie. Immédiatement après, le correspondant ¹⁸Nanobots marqués F (¹⁸F-BSA/¹⁸F-uréase dans eau/urée) ont été instillés dans la vessie à l'aide d'un cathéter de calibre 24 et incubés pendant 1 h, avant de retirer le cathéter, de vider la vessie et de laisser les souris se remettre de l'anesthésie. À t = 3 h après l'administration, les animaux ont été ré-anesthésiés et des images TEP statiques du corps entier de 10 min ont été acquises, suivies d'une tomodensitométrie. Les images TEP ont été reconstruites à l'aide de l'algorithme de reconstruction de maximisation des attentes de sous-ensembles ordonnés en 3D avec des corrections aléatoires, de diffusion et d'atténuation. Les images PET-CT de la même souris ont été co-enregistrées et analysées à l'aide de l'outil de traitement d'image PMOD. Des tracés de concentration de radioactivité en fonction du temps ont été obtenus en créant un volume d'intérêt sur la région supérieure de la vessie à l'aide d'un outil de contour 3D et en mesurant l'activité (dégradation corrigée) en kilobecquerels par organe. Les résultats ont été corrigés en appliquant un facteur d'étalonnage, puis normalisés par le volume tumoral dérivé de l'IRM.

Études ex vivo

Analyses histopathologiques

Après avoir terminé toutes les images, les vessies sélectionnées (n = 3 par groupe) provenant d'animaux sains et porteurs de tumeurs ont été prélevés dans des conditions aseptiques et immédiatement fixés dans du formaldéhyde à 4 %. Ensuite, les vessies ont été incorporées dans de la paraffine avant de prélever des coupes de 2 à 3 µm pour la coloration à l'hématoxyline-éosine. Des images représentatives ont été obtenues dans toutes les conditions pour l'examen histopathologique.

Analyse ICP-MS

Les mesures ont été effectuées sur un Thermo iCAP Q ICP-MS (Thermo Fisher Scientific) couplé à un échantillonneur automatique ASX-560 (CETAC Tech). Après avoir terminé toutes les images, les animaux ont été tués et les vessies sélectionnées (n = 2 par groupe ; quatre groupes) collectés et digérés dans 1 ml de HNO₃:HCl (mélange 4:1). La dispersion a été bouillie jusqu'à ce que les organes soient complètement dissous. Ensuite, la solution a été refroidie à température ambiante et analysée par ICP-MS pour déterminer la concentration d'Au dans chaque échantillon, transformant les résultats en pourcentages de dose injectée par gramme de tissu (%ID g^-1).

Immunohistochimie et imagerie par microscopie confocale

Pour les analyses immunohistochimiques, les animaux porteurs de tumeurs ont reçu des nanobots marqués au FITC dans de l'eau ou 300 mM d'urée (n = 4 par groupe), comme décrit ci-dessus, pour les études TEP-CT. De plus, des animaux porteurs de tumeurs sans nanobots ont servi de groupe témoin (n = 2). Dans tous les cas, les vessies ont été collectées, congelées et coupées en sections de 10 µm qui ont été immédiatement fixées dans du formaldéhyde à 10 % pendant 15 min, lavées avec du PBS 10 mM puis incubées dans du NH 50 mM.₄Cl dans du PBS pendant 5 min avant de rincer à nouveau avec du PBS. La perméabilisation a été réalisée avec du méthanol: acétone (1: 1) pendant 5 min à température ambiante et 0.1% de Triton dans du PBS pendant 5 min. Après lavage au PBS, les échantillons ont été saturés avec une solution de 5 % de BSA à 0.5 % de Tween dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante et incubés pendant 1 heure à température ambiante avec un anti-FITC de souris (1:100, Abcam) dans 5 % de BSA. –0.5% Interpolation. Les coupes ont été lavées trois fois avec du PBS 10 mM pendant 5 min et incubées pendant 30 min à température ambiante avec l'anticorps secondaire Alex Fluor 647 IgG anti-souris d'âne (Molecular Probes, Life Technologies, 1:1,000 5) dans 0.5 % de BSA – 3 % de Tween. dans du PBS, lavé à nouveau dans du PBS (5 × 4,6 min) et monté avec un kit anti-décoloration ProLong avec du 2-diamidino-5-phénylindole (DAPI ; Molecular Probes, Life Technologies). Les images ont été acquises avec un microscope confocal Leica STELLARIS 10 (Parc scientifique UPV/EHU) avec des réglages identiques pour toutes les coupes : grossissement ×4 avec imagerie et assemblage de carreaux (généralement champ de vision 5 × 405). La ligne laser et les fenêtres de détection étaient de 440 nm et 503-489 nm pour le DAPI, de 494 nm et 602-653 nm pour le laser blanc FITC et de 660 nm et 836-647 nm pour le laser blanc AlexaXNUMX.

Compensation optique

Après perfusion avec 4 % de paraformaldéhyde et PBS, les échantillons de vessie ont été prélevés et fixés dans 4 % de paraformaldéhyde pendant une nuit à 4 °C, puis incorporés dans une seringue de 5 ml avec 0.8 % d'agarose à bas point de fusion pour former un bloc cylindrique et permettre une utilisation facile. montage dans la cuvette de quartz. Le bloc entier a été progressivement déshydraté avec du méthanol:H.₂O à 4 °C (30 % : 70 % pendant 1 h, 50 % : 50 % pendant 1 h, 70 % : 30 % pendant 1 h, 100 % : 0 % pendant 1 h, puis 100 % de méthanol pendant une nuit et encore pendant 4 h) et enfin immergé dans de l'alcool benzylique – benzoate de benzyle (BABB) comme solution d'adaptation d'indice de réfraction pour l'imagerie. Pour les comparaisons in vitro de nanobots FITC verts avec des particules rouges commerciales, nous avons utilisé des nanoparticules de silice fluorescentes rouges DiagNano (Creative Diagnostics), d'un diamètre de 1 µm, résistantes à la compensation BABB.

Autofluorescence et imagerie sLS polarisée

L'imagerie par feuille de lumière a été réalisée sur MacroSPIM, un système personnalisé d'imagerie d'organes entiers nettoyé développé à l'IRB Barcelone^44,45. En bref, les échantillons sont intégrés dans un bloc d'agarose, nettoyés avec l'échantillon et imagés dans une cuvette de quartz. L'imagerie par autofluorescence utilisait des lasers à 488, 561 ou 638 nm délivrant un éclairage à travers une lentille cylindrique doublet achromatique de 50 mm (ACY254-050-A, Thorlabs). Pour réduire les artefacts de bandes, la feuille de lumière est pivotée avec un scanner résonant SC-10 (EOPC) le long d'un télescope 4f avec des lentilles doublet achromatiques G322288322 de 100 mm (QI Optic Photonics). L'autofluorescence des tissus est collectée à travers des filtres de fluorescence passe-bande ou passe-long et enregistrée avec une caméra ORCA Flash v2 (Hamamatsu Photonics). L'imagerie a été réalisée à × 9.6, 8 avec un zoom × 2, un objectif × 0.6 et un objectif tube × 5, 6. La feuille de lumière était aplatie sur le champ de vision, produisant une résolution axiale de 3 à 2.5 µm. L’imagerie 2D a été réalisée par pas de 3 µm. L'imagerie de la vessie entière a été réalisée en 3 × 4 ou XNUMX × XNUMX XY tuiles, en fonction de la taille de l'orgue.

L'imagerie sLS a été obtenue en retirant le filtre de fluorescence ou en utilisant n'importe quel filtre transmettant le laser. Le pivotement de la feuille de lumière réduit le bruit de chatoiement du laser, ce qui entraîne une moyenne temporelle de la cohérence du laser, comme indiqué précédemment.⁵². L'orientation de la polarisation linéaire de la feuille de lumière dans l'éclairage a été contrôlée en faisant tourner une plaque demi-onde (AHWP05M-600, Thorlabs) avant le scanner pivot. Le signal détecté a été sélectionné en polarisation à l'aide d'un polariseur linéaire rotatif (LPVISC100, Thorlabs) avant la roue à filtres en détection, introduisant une perte d'intensité > 50 % dans la détection de fluorescence. Bien que la distribution du signal sLS change en général avec l’orientation du polariseur, le signal d’autofluorescence tissulaire n’est pas affecté par la rotation du polariseur. sLS donne une résolution spatiale de 2.4 ± 0.3 µm dans BABB, ce qui est comparable à la résolution de l'imagerie par feuille de lumière de fluorescence (confirmée en ajustant une fonction gaussienne à la XY réponse d'image d'une seule particule, Fig. 8l–m) et proche de la résolution théorique dans l'air (1.53 µm avec ouverture numérique (NA) = 0.2 au zoom macro maximum ×8).

Traitement d'images et analyse 3D

Le traitement des images, la segmentation et l'analyse des ensembles de données de feuilles de lumière ont été effectués avec ImageJ/Fidji, tandis que les Fig. 3 ainsi que 4 ont été générés avec Imaris Viewer 9.9 (https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer) et vidéo supplémentaire 3 a été généré avec Imaris 9 (https://imaris.oxinst.com/) (Bitplan, Oxford Instruments). Les ensembles de données de feuilles de lumière en mosaïque ont été assemblés avec MosaicExplorerJ⁵³. La segmentation 3D des tissus vésicaux a été réalisée à l'aide de macros ImageJ/Fiji personnalisées pour l'annotation 3D semi-automatisée de grands volumes en mode virtuel. En bref, un premier script, « Macro1 », charge des piles d'images 3D, permet à l'utilisateur d'annoter les ROI dans plusieurs plans et d'interpoler automatiquement les ROI pour générer et exporter des masques 3D. Les ROI ont été dessinées tous les 15 plans (tous les 37.5 µm) pour faciliter une bonne continuité de segmentation tout en gardant les annotations à un minimum raisonnable. Un deuxième script, « Macro2 », effectue les opérations mathématiques ou booléennes, plan par plan sans charger l'intégralité des piles en mémoire, soit entre les masques 3D, soit entre un masque 3D et les données d'origine, en enregistrant le résultat sous forme d'une nouvelle pile. Tous les masques ont été générés en annotant des images d’autofluorescence.

Les couches superficielles de la tumeur et des tissus sains (Fig. 3) ont été délimités à l’aide d’une baguette de Fidji et d’outils au lasso sur la cavité vésicale dans un masque. Appelant cette première itération BC1, les exécutions ultérieures de Macro1 dilatent ensuite automatiquement ce contour 3D d'une quantité de pixels définie pour produire de nouvelles itérations de masque, BC2, BC3 et ainsi de suite, avec des dilatations croissantes. La première couche contenant à la fois la tumeur et les tissus sains, le masque L1, est obtenue en soustrayant le masque BC1 de BC2 et ainsi de suite, ce qui donne L2 et L3 sous forme de couches concentriques. Le volume tumoral le plus proche de la cavité a été obtenu en annotant la tumeur avec des outils de baguette et de lasso pour créer un masque T1, tandis que la couche 3D d'urothélium sain a été détectée séparément dans le masque U1. En soustrayant U1 de L1, on obtient la couche superficielle de la tumeur, et ainsi de suite : L2 − U1, L3 − U1. A l’inverse, la première couche de l’urothélium est obtenue en soustrayant T1 de L1. Toutes les couches de la Fig. 3 ont été définis comme ayant une épaisseur de 33 µm.

La même suite de macros et de procédures (outil baguette ImageJ, érosion numérique de 500 µm, etc.) a été utilisée pour délimiter et segmenter la partie interne du tissu vésical, puis estimer le volume tissulaire interne de la vessie (Fig. 4, voir ci-dessus pour plus de détails). Des histogrammes de l'intensité du signal diffusé ont été créés aux Fidji en combinant le signal diffusé et le masque.

RNT utilisant ¹³¹Je-nanobots

Entre les jours 8 et 15 après l'implantation de la tumeur, les animaux ont été divisés en six groupes (groupes 1 à 6), en essayant d'obtenir des volumes tumoraux moyens similaires dans tous les groupes (Tableau 2). Pour les expériences, les animaux ont été induits sous anesthésie (isoflurane à 5 % dans O pur₂) et positionné en décubitus dorsal avant de vider la vessie en massant la région abdominale. Immédiatement après, 100 µl du traitement approprié à une concentration de 400 µg ml^-1 (Table 2) a été instillé dans la vessie à l'aide d'un cathéter de calibre 24. Le traitement et le véhicule (eau ou urée) sont restés dans la vessie pendant 1 h avant de retirer le cathéter. La vessie a été à nouveau vidée par un massage abdominal et les souris ont été récupérées de l'anesthésie dans leurs cages, en remplaçant la sciure des cages des animaux 24 heures après le traitement pour éliminer la contamination radioactive.

Efficacité thérapeutique déterminée par IRM

Deux études IRM ont été réalisées sur chaque souris : (1) entre les jours 7 et 14 après l'inoculation de la tumeur pour randomiser les animaux parmi les groupes et mesurer les volumes tumoraux initiaux (prétraitement) ; (2) entre les jours 16 et 21 après l'inoculation de la tumeur (post-traitement) pour évaluer l'efficacité thérapeutique. L'IRM a été réalisée à l'aide des scanners 7 T Bruker BioSpec et 11.7 T Bruker BioSpec (tous deux avec le logiciel ParaVision 7), en fonction de la disponibilité. Cela n’a pas affecté les résultats puisque le champ externe n’est pas critique pour l’imagerie anatomique.¹⁴. Les expériences d'imagerie ont été menées en utilisant les mêmes paramètres d'imagerie et le même traitement que ceux expliqués ci-dessus (Suivi de la taille de la tumeur). Dans le cas du scanner 11.7 T, la configuration consistait en une bobine de surface cardiaque de souris pour la réception et une bobine volumétrique pour la transmission. Les volumes tumoraux dans chaque tranche ont été déterminés à partir de volumes d'intérêt dessinés manuellement couvrant la zone tumorale.

analyses statistiques

Dans les études d'imagerie TEP, les pourcentages de dose injectée (% ID) et de dose injectée par volume tumoral (% ID cm^-3) ont été comparés à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle. Les différences entre les groupes ont été déterminées à l’aide du test de comparaisons multiples de Tukey. NTV dans la section RNT a été obtenu à partir d'un t-test de valeurs non appariées. La distribution des données a été supposée normale, mais cela n'a pas été formellement testé. Les analyses statistiques ont été effectuées avec GraphPad Prism v.8.

Résumé du rapport

De plus amples informations sur le design de la recherche sont disponibles dans Sommaire des rapports sur le portefeuille de la nature lié à cet article.

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• La source: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01577-y