Préparation et caractérisation des matériaux

La solution aqueuse GO a été diluée dans de l'eau déminéralisée pour obtenir 0.15 mg ml^-1 solution et filtré sous vide à travers une membrane de nitrocellulose avec des pores de 0.025 µm, formant un mince film de GO. Le film mince a ensuite été transféré sur le substrat cible par transfert humide dans de l'eau déminéralisée et recuit thermique supplémentaire à 100 ° C pendant 2 min. L'empilement film-substrat GO a été réduit hydrothermiquement à 134 °C dans un autoclave standard pendant 3 h pour former EGNITE. Le substrat de base pour toutes les études de caractérisation d'EGNITE était un carré (1 × 1 cm²) de Si/SiO₂ (400 μm/1 μm).

XPS

Les mesures XPS ont été effectuées avec un analyseur Phoibos 150 (SPECS) dans des conditions d'ultra-vide (pression de base, 5 × 10^-10 mbar) avec une source de rayons X monochromatique Al Kα (1,486.74 50 eV). Les spectres généraux ont été acquis avec une énergie de passage de 1 eV et une taille de pas de 20 eV et des spectres haute résolution ont été acquis avec une énergie de passage de 0.05 eV et une taille de pas de 0.58 eV. La résolution globale dans ces dernières conditions est de 3 eV, déterminée en mesurant toute la largeur à mi-hauteur de l'Ag XNUMX.d5/2 pic d'argent pulvérisé. L'analyse XPS montre une forte diminution après le traitement hydrothermal du pic C–O (associé aux groupes époxydes), mais une faible contribution de C–OH, C=O et C(O)OH due aux hydroxyles, carbonyles et carboxyles qui subsistent après réduction. La déconvolution de l'O1s Peak confirme un tel comportement. La principale contribution à la C1s Le signal après la réduction hydrothermale provient cependant de sp² orbitales C – C hybridées^34,57.

Diffraction des rayons X

Mesures de diffraction des rayons X (θ-2θ scan) ont été réalisés dans un diffractomètre de recherche sur les matériaux (Malvern PANalytical). Ce diffractomètre a une direction horizontale ω-2θ goniomètre (rayon 320 mm) dans une géométrie à quatre cercles et travaillé avec un tube à rayons X en céramique avec anode Cu Kα (λ = 1.540598 Å). Le détecteur utilisé est un Pixcel qui est un détecteur de rayons X rapide basé sur la technologie Medipix2.

spectroscopie Raman

Les mesures de spectroscopie Raman ont été effectuées à l'aide d'un spectrographe Witec équipé d'une ligne d'excitation laser de 488 nm. Pour les mesures, les spectres Raman ont été acquis à l'aide d'un objectif 50 × et d'un réseau de 600 rainures par nm ; la puissance du laser a été maintenue en dessous de 1.5 mW pour éviter le chauffage de l’échantillon.

TEM

Une lamelle de faisceau d'ions focalisé a été préparée avec un Helios NanoLab DualBeam (LMA-INA) pour l'étude en coupe transversale de l'échantillon EGNITE. Les analyses structurelles ont été effectuées au moyen de TEM à l'aide d'un microscope Tecnai F20 fonctionnant à 200  kV, y compris les techniques HRTEM et STEM à fond noir annulaire à grand angle. L'expérience STEM-EELS a été réalisée dans un microscope Tecnai F20 fonctionnant à 200 KeV, avec une ouverture de 5 mm, une longueur de caméra de 30 mm, un angle de convergence de 12.7 mrad et un angle de collecte de 87.6 mrad. Comme nous avons utilisé 0.5 eV par pixel et 250 eV comme énergie de départ dans l’acquisition de perte de cœur, nous n’avons pas acquis le bord Si K attendu à 1,839 2,122 eV, le bord M Pt à 2,206 100  eV et le bord Au M à XNUMX XNUMX eV. XNUMX XNUMX eV. La composition atomique relative C – O a été obtenue en concentrant notre attention sur la couche GO réduite et en supposant que les bords analysés (C et O dans notre cas) totalisent XNUMX%. Cette hypothèse est valable dans notre cas comme en témoigne le Information supplémentaire Plans. La section efficace différentielle d'énergie a été calculée à l'aide du modèle Hartree – Slater et l'arrière-plan à l'aide d'un modèle à faible puissance.

Conductivité électrique

Les mesures de conductivité électrique ont été effectuées à l'aide d'un sourcemètre Keithley 2400 en configuration à deux points. Les échantillons mesurés étaient constitués de films EGNITE de 1 × 1 cm² au dessus d'un SiO₂ substrat.

L'analyse des données

Les données de diffraction des rayons X, Raman et XPS ont été analysées à l'aide des packages Python 3.7 (Numpy, Pandas, Scipy, Xrdtools, Lmfit, Rampy, Peakutils, Matplotlib). La distance entre les plans a été calculée à partir des mesures de diffraction des rayons X selon la loi de Snell. Une fois les données déplacées dans le domaine spatial, le maximum des pics a été ajusté. La distance correspondante donnait une valeur moyenne de la distance entre plans. Les écarts par rapport à ces valeurs moyennes ont été calculés à partir de la pleine largeur à mi-hauteur des ajustements lorentziens des pics sur le domaine spatial. Les mesures de spectroscopie XPS et Raman ont été analysées en ajustant une convolution de pics aux emplacements attendus pour les caractéristiques correspondantes. Les valeurs de conductivité du GO et de l'EGNITE ont été obtenues en ajustant le I-V courbes mesurées dans les mesures de conductivité électrique selon la loi d’Ohm. Les données sont n = 1 pour chaque mesure.

Fabrication de matrices flexibles

La fabrication des dispositifs est illustrée dans la figure supplémentaire. 4. Les appareils ont été fabriqués sur du Si/SiO de 4 pouces₂ (400 μm/1 μm) tranches. Tout d’abord, une couche de PI de 10 µm d’épaisseur (PI-2611, HD MicroSystems) a été déposée par centrifugation sur la tranche et cuite dans une atmosphère riche en azote à 350 °C pendant 30 min. Les traces métalliques ont été modelées par lithographie optique de la résine photosensible d'inversion d'image (AZ5214, Microchemicals). L'évaporation par faisceau d'électrons a été utilisée pour déposer 20 nm de titane et 200 nm d'or et un décollage a été effectué. Nous avons utilisé un film EGNITE d'environ 1 μm d'épaisseur comme compromis entre performances électrochimiques et flexibilité du réseau. Après avoir transféré le film GO, l'aluminium a été évaporé par faisceau électronique et les zones situées au-dessus des futures microélectrodes ont été définies à l'aide d'une résine photosensible négative (nLOF 2070, Microchemicals) et décollées. Ensuite, le film GO a été gravé partout, à l'exception des futures microélectrodes, en utilisant une gravure ionique réactive à l'oxygène (RIE) pendant 5   min à 500   W et les colonnes protectrices en aluminium ont été gravées avec une solution diluée d'acides phosphorique et nitrique. Ensuite, une couche de PI-3 de 2611 µm d’épaisseur a été déposée sur la plaquette et cuite comme décrit précédemment. Les ouvertures PI-2611 sur la microélectrode ont ensuite été définies à l'aide d'une résine photosensible épaisse positive (AZ9260, Microchemicals) qui servait de masque pour un RIE ultérieur à l'oxygène. Plus tard, les dispositifs ont été modelés sur la couche PI, toujours en utilisant la résine photosensible AZ9260 et le RIE. La couche de résine photosensible a ensuite été retirée dans de l'acétone et la plaquette a été nettoyée dans de l'alcool isopropylique et séchée. Enfin, les dispositifs ont été décollés de la plaquette et étaient prêts à être placés dans des sachets de stérilisation pour être traités hydrothermiquement à 134 °C dans un autoclave standard pendant 3 h.

Caractérisation électrochimique des microélectrodes

La caractérisation électrochimique des microélectrodes a été réalisée avec un potentiostat Metrohm Autolab PGSTAT128N dans du PBS 1 × (Sigma-Aldrich, P4417) contenant 10 mM de tampon phosphate, 137 mM de NaCl et 2.7 mM de KCl à pH 7.4 et en utilisant une configuration à trois électrodes. Une électrode Ag/AgCl (FlexRef, WPI) a été utilisée comme référence et un fil de platine (Alfa Aesar, 45093) a été utilisé comme contre-électrode.

Avant l'évaluation des performances, les électrodes ont été pulsées avec 10,000 1 impulsions à charge équilibrée (15 ms, 100 µA). L'exposition des électrodes à des protocoles d'impulsions continues s'est déroulée par 0.9 cycles de voltammétrie cyclique (−0.8 à +50 V) à XNUMX mV s^-1, 20 répétitions de 5,000 1 impulsions (XNUMX ms) et redétermination du potentiel de circuit ouvert.

L'analyse des données

Les données de caractérisation électrochimique ont été analysées à l'aide des packages Python 3.7 (Numpy, Pandas, Scipy, Pyeis, Lmfit, Matplotlib). Les données de spectroscopie d'impédance ont été adaptées à un modèle électrique équivalent constitué d'une résistance (R) en série avec un élément à phase constante (CPE). À partir de là, la valeur CPE a été approchée d'une capacité et divisée par la zone géométrique de la microélectrode pour obtenir une valeur équivalente pour la capacité interfaciale d'EGNITE. La capacité de stockage de charge des microélectrodes (CSC) a été calculée à partir de mesures de voltamétrie cyclique en intégrant les régimes cathodique et anodique du courant mesuré et en normalisant par la vitesse de balayage. La capacité de stockage de charge cathodique et anodique (cCSC et aCSC) à une vitesse de balayage de 100 mV d'EGNITE est de 45.9 ± 2.4 et 34.6 ± 2.8 mC cm^-2, respectivement (n = 3). Comme indiqué pour d'autres matériaux⁵⁸, les CSC obtenus dépendent de la vitesse de balayage (Fig. 5). Pour évaluer la présence de réactions de réduction de l'oxygène, nous avons mesuré la forme d'onde CV sous électrolyte purgé à l'azote.⁵⁹ et n'a pas observé de différences substantielles dans la forme d'onde (Fig. 6). Cependant, nos résultats ne traitent pas pleinement de l’impact des réactions de réduction de l’oxygène sur la capacité d’injection de charge d’EGNITE et des travaux supplémentaires doivent être effectués pour étudier correctement ce problème. La capacité d'injection de charge des microélectrodes (CIC) a été établie en déterminant l'amplitude de l'impulsion de courant qui a provoqué une différence de tension (après suppression de la chute ohmique) qui correspondait à la fenêtre d'eau électrochimique de l'électrode (−0.9 V pour cathodique et +0.8 V pour anodique par rapport à Ag/AgCl ) (Fig. 17)⁶⁰.

analyses statistiques

Les données sont moyennes ± écart-type, n = 18 pour EIS et n = 3 pour les chronopotentiométries. Les données de la carte d'excursion de tension capacitive cathodique sont la moyenne des excursions de tension capacitive cathodique pour un événement pour chaque forme d'impulsion de n = 3 électrodes.

Évaluation de la stabilité mécanique

Sonication par ultrasons

Des réseaux d'électrodes EGNITE ont été placés dans un bécher rempli d'eau dans un bain-marie à ultrasons (Elmasonic P 180H). La sonication a été appliquée à 37 kHz pendant 15 min à 200 W, et suivie de 15 min supplémentaires de sonication à 37 kHz avec une puissance élevée à 300 W. Des images d’électrodes ont été acquises avant et après les étapes de sonication.

Test de flexion

Le montage du pliage (Fig. 2k) composé de trois tiges cylindriques ; celui du milieu (diamètre 700 µm) a été abaissé, produisant des angles de courbure de 131°. Trois réseaux de microélectrodes flexibles ont été utilisés pour le test de flexion. Chaque réseau contenait 18 microélectrodes de 50 µm de diamètre. Deux matrices ont été mesurées après 10 et 20 cycles, tandis qu'un appareil n'a été mesuré que pendant 10 cycles car il avait été endommagé lors de la manipulation après la mesure. Le cycle d'essai de flexion consistait en une application de charge de 10 s plus 10 s sans charge. Les dispositifs ont été caractérisés électrochimiquement (EIS et CV) avant et après 10 et 20 cycles de pliage.

Enregistrement neuronal épicortique

Implantation épicorticale

Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées conformément aux recommandations du Conseil de la Communauté européenne et à la législation française relative au soin et à l'utilisation des animaux de laboratoire. Les protocoles ont été approuvés par le comité d'éthique de Grenoble (ComEth) et autorisés par le ministère français (numéro 04815.02). Rats Sprague-Dawley (mâles, âgés de 4 mois, pesant ~600 g) ont été anesthésiés par voie intramusculaire avec de la kétamine (50 mg par kg (poids corporel)) et de la xylazine (10 mg par kg (poids corporel)), puis fixés sur un support stéréotaxique. Le retrait du crâne temporal a exposé le cortex auditif. La dure-mère a été préservée pour éviter d'endommager le tissu cortical. Un trou a été percé au sommet pour insérer l'électrode de référence, et un deuxième trou, à 7 mm vers l'avant du premier, a été percé pour insérer l'électrode de masse. Les électrodes étaient des broches de 0.5 mm d'épaisseur utilisées pour les supports de circuits intégrés. Ils ont été placés pour établir un contact électrique avec la dure-mère et fixés au crâne avec du ciment dentaire. Nous avons ensuite monté le ruban de microélectrodes de surface sur le cortex auditif, comme le montre la Fig. 3b. Les schémas veineux identifient le cortex auditif, dans la zone 41 de la carte cérébrale du rat de Krieg. Les signaux corticaux ont été simultanément amplifiés avec un gain de 1,000 33 et numérisés à une fréquence d'échantillonnage de 20 kHz. Un haut-parleur situé à 0.25 cm devant l’oreille d’un rat, controlatéral au cortex exposé, délivrait des stimuli acoustiques. Les stimuli délivrés ont été surveillés par un microphone de 4939 pouce (Brüel & Kjaer, 20) placé près de l'oreille et présenté en niveau de pression acoustique (dB SPL re 80 μPa). Nous examinons les réponses de latence moyenne positives (négatives vers le haut) évoquées par des clics alternés à 70 dB SPL et des stimuli de tonalité à 5 dB SPL avec des fréquences allant de 40 à 5 kHz, un temps de montée et de descente de 200 ms et une durée de XNUMX ms.

L'analyse des données

Les données électrophysiologiques ont été analysées à l'aide des packages Python 3.7 (Numpy, Pandas, Scipy, Neo, Elephant, Sklearn Matplotlib) et de la bibliothèque personnalisée PhyREC (https://github.com/aguimera/PhyREC). r.m.s. les valeurs ont été calculées avec une fenêtre glissante de 20 ms à des fréquences supérieures à 200 Hz. Les spectrogrammes ont été calculés pour une plage comprise entre 70 Hz et 1.1 kHz. La PSD a été calculée sur 60 secondes d’enregistrements continus. Pour un réseau d'électrodes donné, deux PSD ont été calculés : in vivo (IV) et post mortem (PM). Le SNR est exprimé en dB (20 × ln(r.m.s.(IV)/r.m.s.(PM))) et interpolé sur 20 points logarithmiquement espacés entre 10 Hz et 1 kHz.

analyses statistiques

Les données neuronales épicorticales présentées dans la Fig. 3 sont issus de mesures individuelles sur un seul animal. En figue. 3c, les données de 64 électrodes sont présentées. En figue. 3d, les données de deux électrodes sélectionnées sont présentées. En figue. 3f, le PSD et le SNR sont calculés à partir de 64 électrodes EGNITE et sont affichés sous forme de moyenne ± s.d. Dans la figure supplémentaire. 12c,d les données médianes sont présentées pour 192 électrodes EGNITE de n = 3 expériences et 60 électrodes de platine de n = 1 expérience.

Enregistrement neuronal intracortical

Implantation intracorticale

Les animaux ont été anesthésiés avec un mélange de kétamine/xylazine (75 : 1, 0.35 ml/28 g i.p.) et cet état a été maintenu avec un masque d'inhalation fournissant 1.5 % d'isoflurane. Plusieurs microvis ont été placées dans le crâne pour stabiliser l’implant, et celle située au sommet du cervelet a été utilisée comme support général. La sonde a été implantée dans le cortex préfrontal (coordonnées : AP, 1.5 mm ; ML, ±0.5 mm ; DV, −1.7 mm du bregma). L'implantation a été réalisée en enduisant la sonde de maltose (voir protocole ci-dessous) pour fournir une rigidité temporaire à la sonde et faciliter l'insertion de la sonde. La sonde a été scellée avec du ciment dentaire. Des connecteurs TDT-ZifClip ont été utilisés pour connecter la sonde au système électrophysiologique via un câble miniaturisé. Après l’opération, la souris a subi une période de récupération d’une semaine sous traitement analgétique (buprénorphine) et anti-inflammatoire (méloxicam). L'activité neuronale a été enregistrée avec le système multicanal Open Ephys à une fréquence d'échantillonnage de 1 kHz avec un amplificateur Intan RHD30. Les expériences de tâches auditives ont été menées dans une boîte insonorisée, avec deux haut-parleurs à l'intérieur, en utilisant des protocoles basés sur les travaux décrits précédemment.⁶¹. Le stimulus sonore consistait en un clic de bruit blanc de 15 ms, répété 100 fois (cycles), chacun séparé de 5 secondes (intervalle interstimulus). Durant cette tâche, l’animal était capable de se déplacer librement.

Protocole raidisseur maltose

Une solution aqueuse de maltose est chauffée jusqu'au point de transition vitreuse (T_g), entre 130 et 160 °C, sur plaque chauffante ou au micro-ondes. Une fois le maltose visqueux, l'arrière de la sonde est mis en contact uniquement avec le maltose. En refroidissant, le maltose rigidifie et rigidifie la sonde.

L'analyse des données

Les signaux neuronaux de chaque électrode ont été filtrés hors ligne pour extraire les SUA et les LFP. La SUA a été estimée en filtrant le signal entre 450 et 6,000 4 Hz et les pointes des neurones individuels ont été triées à l'aide d'une analyse en composantes principales avec Offline Sorter v.1 (Plexon). Pour obtenir les LFP, les signaux ont été sous-échantillonnés à 50 kHz, détendus et filtrés par coupe-bande pour supprimer les artefacts de lignes de bruit (1 Hz et ses harmoniques) avec des scripts personnalisés en Python. L'AEP SNR a été calculé comme le rapport entre l'amplitude maximale de N20 et l'écart-type. d'une période de XNUMX ms avant le stimulus.

analyses statistiques

Les données présentées dans la Fig. 3h, je sont moyennes ± écart-type, n = 30 comme nombre d'essais moyenné. Les données enregistrées à partir de la même électrode sont présentées aux jours 30, 60 et 90. Les données d'un seul animal sont présentées.

Biocompatibilité épicorticale chronique

Implantation chirurgicale de dispositifs

Au total, 27 rats Sprague-Dawley mâles adultes ont été utilisés pour cette étude (Charles River). Les animaux ont été hébergés à une température ambiante de 21 ± 2 °C et une humidité de 40 à 50 %, selon un cycle de lumière de 12 h/12 h d’obscurité. Les rats ont été hébergés en groupes et ont eu libre accès à la nourriture et à l’eau tout au long de la période expérimentale. Les procédures expérimentales ont été réalisées conformément à la loi sur le bien-être animal (1998), avec l'approbation du ministère de l'Intérieur du Royaume-Uni et de l'organisme local d'examen éthique du bien-être animal (AWERB). Les animaux ont été anesthésiés avec de l'isoflurane (2 à 3 %) pendant toute la durée de l'intervention chirurgicale et la profondeur de l'anesthésie a été surveillée par le test du réflexe de pincement des orteils. Les animaux ont été placés dans un cadre stéréotaxique (Kopf, 900LS), situé au-dessus d'une couverture thermique pour maintenir la température corporelle. Un trou de craniotomie (~5 mm ×4 mm) a été réalisée à 1 mm de la ligne médiane à l’aide d’une fraise dentaire avec une fraise de 0.9 mm, la dure-mère a été retirée et le dispositif épicortical placé sur la surface corticale du cerveau. Le trou de craniotomie a été scellé avec du Kwik-sil, suivi de ciment dentaire pour le fixer, et la peau a été suturée. Des injections sous-cutanées de solution saline (1 ml par kg (poids corporel)) et de buprénorphine (0.03 mg par kg (poids corporel)) ont été administrées pour remplacer les liquides perdus et réduire la douleur postopératoire, et l'anesthésie a été interrompue.

Collecte et traitement de tissus

Les animaux ont été éliminés 2, 6 ou 12 semaines après l'implantation par une méthode appropriée au type d'analyse à effectuer.

Histologie et immunohistochimie

À 2, 6 ou 12 semaines après l'implantation, les rats ont été licenciés par perfusion cardiaque avec du sérum hépariné (10 U ml^-1, Sigma-Aldrich) PBS, suivi de 4 % de paraformaldéhyde (PFA, Sigma-Aldrich) dans du PBS. Les cerveaux ont été postfixés dans du PFA à 4 % pendant 24 heures, puis transférés dans du saccharose à 30 % dans du PBS pendant au moins 48 heures avant d'être congelés dans de l'isopentane. Les cerveaux ont ensuite été stockés à -80 °C jusqu'à ce qu'ils soient cryosectionnés à 25 µm. Le tissu a ensuite été coloré pour la molécule adaptatrice de liaison au calcium ionisée 1 (Iba-1) afin de déterminer le niveau d’activation microgliale. En bref, des coupes de tissus ont été bloquées avec 5 % de sérum de chèvre dans du PBS avec 0.1 % de Triton-X pendant 1 h avant une nuit d'incubation à 4 °C avec l'anticorps primaire anti-Iba-1 (1 : 1,000 019, 19741-594 ; Wako). Les coupes ont ensuite été colorées avec un anticorps secondaire, anti-lapin Alexa Fluor 1 (400: 11012, A-1; Thermo Fisher) pendant 4,6 h à température ambiante. Les lames ont été montées avec des lamelles en utilisant un support de montage anti-décoloration Prolong Gold avec du 2-diamidino-3-phénylindole (Thermo Fisher). La sonde couvrait une zone de 3.7 × XNUMX mm² sur la surface corticale du cerveau ; les coupes de tissus sélectionnées pour la coloration couvraient 3.2 mm de longueur de cette région. Les lames ont été imagées à l'aide d'un scanner de lames de microscope 3DHistech Pannoramic-250 à 20 × et les images ont été analysées à l'aide de CaseViewer v.2.4 (3DHistech). Pour évaluer l’activation des microglies, une zone de 3.2 mm a été couverte, avec une image analysée tous les 100 µm. Des images ont été prises avec un grossissement de 8.5 × qui détaillaient une section du site de la sonde épicorticale, à 3 mm de la ligne médiane du cerveau, englobant la zone située directement sous le site de la sonde.

Traitement d'image

Les données de microscopie ont été traitées par image à l'aide d'un algorithme de caractérisation du phénotype des microglies (Fig. 13). L'activation microgliale a été analysée à l'aide d'un CellProfiler* personnalisé (Broad Institute, v.3.1.9 de https://cellprofiler.org/) canalisation. Tout d’abord, le module EnhanceOrSuppressFeatures a été utilisé pour améliorer les structures filamenteuses telles que les neurites en appliquant la méthode d’amélioration de la tubérisation. À partir des images améliorées, les cellules ont été segmentées à l'aide du module EnsurePrimaryObjects. Les mesures préliminaires des cellules suggèrent que la plage appropriée de diamètres d'objet était comprise entre 3 et 40 pixels. Les objets en dehors de cette plage de diamètres ou touchant le bord de l’image ont été écartés. Les cellules ont été segmentées à l'aide d'une stratégie de seuillage adaptatif Otsu à deux classes avec une taille de fenêtre adaptative de 50 pixels. Les objets identifiés par le module EnsurePrimaryObjects ont été entrés dans le module MeasureObjectSizeShape pour calculer les propriétés nécessaires à la classification des cellules. Dans le module ClassifyObjects, la catégorie sur laquelle baser les classifications a été spécifiée comme étant AreaShape et Extent a été sélectionnée comme mesure correspondante. Les cellules ont été classées comme »activé » ou « non activé » en fonction de leur propriété Extent, qui est le rapport entre la surface occupée par la cellule et la surface occupée par son cadre de délimitation. Cette approche de classification a été rationalisée par le fait que les microglies activées ont de grands corps cellulaires et aucun processus, et occupent ainsi une proportion beaucoup plus grande de leurs boîtes englobantes que leurs homologues non activées. Enfin, les modules CalculateMath et ExportToSpreadsheet ont été utilisés pour calculer et générer les statistiques souhaitées.

analyses statistiques

Les ensembles de données sont n = 3 pour chaque type de dispositif (implant PI uniquement (PI ); PI avec de l'or microfabriqué exposé (or) ; et PI avec de l'or microfabriqué et de l'EGNITE (EGNITE) à tout moment) à l'exception de l'or de 6 semaines qui est n = 2 pour les données ELISA. Les hémisphères controlatéraux ont été combinés à chaque instant pour donner n = 9 à 2 et 12 semaines postimplantation et n = 8 à 6 semaines postimplantation. L'analyse des données a été réalisée à l'aide du logiciel GraphPad Prism v.8. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'une analyse de variance bidirectionnelle (ANOVA) avec le test de comparaisons multiples de Tukey, le cas échéant ; P < 0.05 a été jugé significatif.

ELISA

Après la période d'implantation, les animaux ont été tués par luxation cervicale. Le tissu cérébral a été extrait des hémisphères droit et gauche du cerveau, congelé dans de l'azote liquide et conservé à -80 ° C jusqu'à une utilisation ultérieure. Les tissus ont été lysés en utilisant un tampon de lyse NP-40 (NaCl 150 mM, Tris-Cl 50 mM, substitut Nonidet P1 à 40%, Fluka, pH ajusté à 7.4) contenant un inhibiteur de protéase et de phosphatase (Cocktail d'inhibiteur de protéase et de phosphatase Halt, Thermo Fisher), suivie d'une rupture mécanique du tissu (TissueLyser LT, Qiagen). Les échantillons ont ensuite été centrifugés pendant 10 minutes à 5,000 4 tr/min et le surnageant a été conservé à 740401 °C jusqu'à une utilisation ultérieure. Le panel LEGENDplex Rat Inflammation (numéro de catalogue 1, BioLegend), un kit ELISA multiplex à base de billes, a été exécuté pour quantifier les cytokines suivantes : IL-1α, IL-6β, IL-10, IL-12, IL-70p17, IL-18A, IL-33, IL-1, CXCL2 (KC), CCL1 (MCP-15), stimulation des colonies de granulocytes et de macrophages facteur, interféron-γ et facteur de nécrose tumorale. Le kit a été exécuté conformément aux instructions du fabricant, avec des protéines chargées à un volume fixe de XNUMX µl. Après l'incubation avec le surnageant, les billes ont été analysées sur un cytomètre en flux BD FACSVerse et les données analysées à l'aide du logiciel d'analyse de données LEGENDplex.

Stimulation neuronale

Implantation intrafasciculaire

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité d'éthique de l'Universitat Autònoma de Barcelona conformément à la directive 2010/63/UE du Conseil des Communautés européennes. Les animaux ont été hébergés à 22 ± 2 °C sous un cycle de lumière de 12 h/12 h d’obscurité avec de la nourriture et de l’eau librement disponibles. Le nerf sciatique de rats Sprague-Dawley femelles anesthésiés (250 à 300 g, ~18 semaines) a été exposé chirurgicalement et les électrodes TIME ont été implantées transversalement à travers le nerf sciatique à l'aide d'une aiguille droite attachée à un fil à boucle 10-0.⁴⁶. Le processus a été surveillé au microscope à dissection pour garantir la position correcte des sites actifs à l’intérieur des fascicules nerveux (Fig. 4b). Au cours des expériences, la température corporelle de l’animal a été maintenue à l’aide d’un coussin chauffant.

La stimulation nerveuse a été réalisée en appliquant des trains d'impulsions de courant biphasiques d'une durée fixe de 100 µs par phase et augmentant l'amplitude de 0 à 150 µA par pas de 1 ou 3 µA à 3 Hz pendant 33 s (Stimulateur DS4, Digitimer) à travers les différents EGNITE. microélectrodes. Simultanément, les CMAP ont été enregistrées à partir des muscles GM, TA et PL à l'aide de petites électrodes-aiguilles (13 mm de long, 0.4 mm de diamètre, électrodes-aiguilles en acier inoxydable A-03-14BEP, Bionic) placées dans chaque muscle.⁶². L'électrode active a été placée sur le ventre musculaire et la référence au niveau du tendon. Les enregistrements électromyographiques ont été amplifiés (× 100 pour GM et TA, × 1,000 511 pour PL; amplificateurs P3AC, Grass), filtrés passe-bande (3 Hz à 16 kHz) et numérisés avec un système d'enregistrement PowerLab (PowerLab20SP, ADInstruments) à XNUMX kHz.

L'analyse des données

L'amplitude de chaque CMAP a été mesurée depuis la ligne de base jusqu'au pic négatif maximum. Les mesures de pic de tension ont été normalisées à l'amplitude CMAP maximale obtenue pour chaque muscle de l'expérience. Un indice de sélectivité (SI) a été calculé pour chaque site actif comme le rapport entre l'amplitude CMAP normalisée pour un muscle, CMAP_i, et la somme des amplitudes CMAP normalisées dans les trois muscles, suivant la formule SI_i = nCMAP_i/∑nCMAP_j, à l'amplitude minimale du courant de stimulation qui a suscité une réponse musculaire fonctionnellement pertinente minimale (définie comme une amplitude CMAP d'au moins 5 % pour l'un des muscles par rapport à l'amplitude CMAP maximale de ce muscle qui avait été précédemment déterminée). Ensuite, les sites actifs avec le SI le plus élevé pour chacun des trois muscles ont été sélectionnés comme SI pour chaque muscle dans une expérience donnée.

Biocompatibilité intraneurale chronique

Suite à une procédure précédemment signalée^50,63, le nerf sciatique de rats femelles Sprague-Dawley anesthésiés (250-300 g, ~18 semaines) a été exposé et les dispositifs de biocompatibilité in vivo avec et sans EGNITE ont été implantés longitudinalement dans la branche tibiale du nerf sciatique (n = 6 à 8 par groupe). En bref, le nerf est percé au niveau de la trifurcation avec une aiguille droite attachée à un fil à boucle 10-0 (STC-6, Ethicon) ; le fil tire la pointe en forme de flèche de la bande d'électrode pliée. La pointe est coupée pour enlever le fil, et les pointes de chaque bras sont légèrement pliées pour éviter le retrait de l'appareil. Un implant longitudinal a été choisi car il permet une meilleure étude de la réponse aux corps étrangers à l'intérieur du nerf⁵⁰.

Évaluation fonctionnelle nerveuse et animale

Les animaux ont été évalués lors du suivi post-implantation au moyen de tests de conduction nerveuse, d'algésimétrie et de locomotion sur piste de marche.⁶². Pour les tests de conduction, le nerf sciatique des pattes implantées et controlatérales a été stimulé par des électrodes-aiguilles au niveau de l'encoche sciatique et le CMAP du muscle PL a été enregistré comme ci-dessus. La latence et l'amplitude du CMAP ont été mesurées. Pour le test d'algésimétrie, les rats ont été placés sur une plate-forme grillagée et un stimulus mécanique non nocif a été appliqué avec une pointe métallique connectée à un algésimètre électronique Von Frey (Bioseb). Le seuil nociceptif (force en grammes à laquelle les animaux ont retiré la patte) des pattes implantées versus controlatérales a été mesuré. Pour le test de piste de marche, la surface plantaire des pattes postérieures a été peinte avec de l'encre noire et chaque rat a été laissé marcher le long d'un couloir. Les empreintes ont été collectées et l'indice fonctionnel sciatique calculé⁶².

Histologie

Après 2 ou 8 semaines, les animaux ont été perfusés avec du PFA (4 %) et les nerfs sciatiques ont été prélevés, postfixés, cryoconservés et traités pour analyse histologique. Pour l'évaluation du FBR, les nerfs sciatiques ont été coupés en coupes transversales de 15 µm d'épaisseur avec un cryostat (Leica CM190). Les échantillons ont été colorés avec des anticorps primaires contre les axones myélinisés (anti-RT97 pour marquer Neurofilament 200K, 1 : 200 ; banque d'hybridomes d'études de développement) et les macrophages (anti-Iba-1, 1 : 500 ; Wako). Ensuite, les coupes ont été incubées pendant 1 h à température ambiante avec des anticorps secondaires d'âne anti-souris Alexa Fluor 488 et d'âne anti-lapin Alexa Fluor 555 (1: 200, Invitrogen). Des coupes représentatives de la partie centrale de l'implant dans le nerf tibial ont été sélectionnées, des images prises avec un microscope à épifluorescence (Eclipse Ni, Nikon) connecté à un appareil photo numérique (DS-Ri2, Nikon) et une analyse d'images réalisée avec le logiciel ImageJ (National Institutes de la santé). La quantité de cellules Iba-1-positives dans toute la zone du nerf tibial a été quantifiée et l'épaisseur de la capsule tissulaire a été mesurée comme la distance moyenne de chaque côté de l'implant aux axones les plus proches.

analyses statistiques

Pour l'analyse statistique des données, nous avons utilisé une ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle suivie du test post hoc de Bonferroni pour les différences entre les groupes ou les moments. Le logiciel GraphPad Prism a été utilisé pour la représentation graphique et l'analyse. La signification statistique a été prise en compte lorsque P <0.05.

Résumé du rapport

De plus amples informations sur le design de la recherche sont disponibles dans Sommaire des rapports sur le portefeuille de la nature lié à cet article.

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• La source: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01570-5