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Les cellules de niche périvasculaires détectent la thrombocytopénie et activent les cellules souches hématopoïétiques de manière dépendante de l'IL-1 – Nature Communications

Date :

L'épuisement aigu des plaquettes recrute rapidement des CSH au repos dans la prolifération

En ligne avec les études précédentes9, administration d'une dose unique d'anticorps anti-GPIbα à VWF-Les souris GFP, pour imiter la thrombocytopénie observée chez les patients atteints de purpura thrombocytopénique immunitaire (PTI), ont rapidement et efficacement épuisé leurs plaquettes en 1 jour sans affecter de manière significative les autres lignées de cellules sanguines (Fig. 1a). Cela s'est accompagné d'une activation rapide (en 1 jour) du cycle cellulaire de Lin-Échelle1+c-Kit+ (LSK) Flt3-CD48-CD150+ HSC. Le recrutement dans le cycle cellulaire actif a été préférentiellement observé au sein de la VWF-GFP+ (VWF+) Compartiment HSC (Fig. 1b-d), qui est enrichi en CSH biaisées en plaquettes mais contient principalement des CSH reconstituantes multilignées9,18. Alors que plus de 60% de Vwf+ LSKFlt3-CD48-CD150+ Les CSH sont entrées dans la phase S-G2-M du cycle cellulaire, seule une petite fraction de VWF-GFP- (VWF-) Les HSC sont entrés dans S-G2-M. Néanmoins, la plupart des Vwf- Les CSH sont passées d'un stade de repos (G0) à un stade G1 plus activé (Fig. 1c, d).

Fig. 1 : Activation rapide de Vwf+ Les CSH en réponse à une déplétion plaquettaire aiguë précèdent la restauration de l'homéostasie plaquettaire.
la figure 1

(En relation avec les figures supplémentaires. 1 et 2). a Analyse cinétique des paramètres des cellules sanguines périphériques après l'administration d'un anticorps anti-GPIbα. Les souris du jour 0 ont été traitées avec un anticorps témoin d'isotype IgG. Les données représentent la moyenne ± SEM de 10 (Jour0), 13 (Jour1), 10 (Jour2), 9 (Jour3), 8 (Jour5) et 7 (Jour10) souris issues de 14 expériences indépendantes. Plaquettes PLT, globules blancs WBC, globules rouges RBC. b Profils FACS représentatifs et stratégie de contrôle des VWF-GFP+ (VWF+) et VWF-GFP- (VWF-) LSKFlt3-CD150+CD48- CSH aux moments indiqués après l'épuisement des plaquettes. Les nombres dans les portes/quadrants indiquent la fréquence (moyenne de toutes les souris analysées) de la population de cellules fermées parmi les cellules vivantes totales (panneaux supérieurs) ou parmi les CSH (panneaux inférieurs). c, d Analyse du cycle cellulaire de Vwf+ et VWF- LSKFlt3-CD150+CD48- CSH aux moments indiqués après l'épuisement des plaquettes. c Profils FACS représentatifs du cycle cellulaire de Vwf+ (à gauche) et Vwf- (à droite) HSC en G0 (DAPI-Ki67-) G1 (DAPI-Ki67+) ou S-G2-M (DAPI+Ki67+) phases du cycle cellulaire. Les nombres dans les portes représentent les fréquences (moyenne de toutes les souris analysées) du total des CSH. d Répartition moyenne ± SD des phases du cycle cellulaire de Vwf+ (à gauche) et Vwf- (à droite) HSC. Données de 5 (Jour0), 5 (Jour1), 3 (Jour2), 5 (Jour3), 5 (Jour5) et 4 (Jour10) souris provenant de 6 expériences indépendantes. ***p <0.001; **p < 0.01 pour la fraction du cycle cellulaire S-G2-M ; # # #p < 0.001 pour la fraction du cycle cellulaire G1 (les deux utilisant une ANOVA bidirectionnelle avec les comparaisons multiples de Tukey) ; e Nombres absolus de Vwf+ et VWF- HSC (par 2 pattes, voir méthodes). Données moyennes ± SEM de 8 (Jour 0), 8 (Jour 1), 7 (Jour 2), 5 (Jour 3), 6 (Jour 5) et 5 (Jour 10) souris issues de 9 expériences indépendantes. ***p < 0.001 pour Vwf+ HSC (ANOVA bidirectionnelle avec comparaisons multiples de Tukey) ; #p <0.05 et ###p < 0.001 pour la comparaison de Vwf+ contre Vwf- HSC (ANOVA bidirectionnelle avec comparaisons multiples de Sidak). Heure d'apparition du premier Mk (f) et fréquence des colonies avec uniquement des cellules Mk (g) dans un Vwf unique cultivé-ou VWF+ CSH isolées de souris 16 heures après le traitement par IgG ou GPIbα. Données de 138, 364, 147 et 451 colonies dérivées de cellules uniques analysées, respectivement, à partir de 5 répétitions biologiques dans 4 expériences indépendantes. f La ligne médiane représente la médiane, les limites des cases représentent les 25 à 75 centiles, les moustaches marquent les 5 à 95 centiles. Les cellules en dehors des percentiles 5 à 95 sont marquées comme valeurs aberrantes. P valeurs calculées avec le test de Kruskal – Wallis avec les comparaisons multiples de Dunn. g P valeur calculée avec le test exact de Fisher bilatéral. ***p <0.001; **p < 0.01 ; *p < 0.05 ; ns, non significatif (p > 0.05). h Analyse de la prolifération de la biotine VWF-GFP+ CSH 2 jours après le traitement par IgG ou GPIbα. Terrain représentatif (à gauche) et moyenne ± SD MFI (normalisé pour le MFI du contrôle sans marquage de biotine ; à droite) de 6 souris par groupe dans 3 expériences indépendantes. **p < 0.01 ; calculé avec un test t bilatéral. Reconstitution à long terme (16 semaines) des lignées de cellules plaquettaires, myéloïdes et lymphoïdes dans le sang (i) et du compartiment BM HSC (j) par biotine élevée et biotine faible VWF-GFP+ Fractions HSC 2 jours après la déplétion plaquettaire. 50 cellules transplantées par souris. Les données représentent la moyenne ± SEM de 4 donneurs dans 2 expériences indépendantes. Chaque point représente la moyenne de 2 souris receveuses transplantées par donneur. ns, non significatif (p > 0.05); calculé avec des tests t bilatéraux. Voir également les figures supplémentaires. 1 et 2.

Nous avons ensuite cherché à explorer davantage les bases mécanistiques de l’activation des CSH observée après une déplétion plaquettaire. L'anticorps anti-GPIbα se lie au GPIbα (CD42b), le récepteur de la thrombine et du VWF19, conduisant à l'activation des plaquettes, à la désialylation et à leur clairance ultérieure, indépendamment du récepteur Fc20. GPIbα est spécifiquement exprimé dans la lignée des plaquettes mégacaryocytaires (Mk), y compris sur les MkP, mais de manière importante pour nos études et comme indiqué précédemment par d'autres21, l'expression de GPIbα est pratiquement indétectable sur les CSH (Fig. 1a). Après la déplétion plaquettaire initiale, le nombre de plaquettes s'est lentement rétabli, avec un nombre normal de plaquettes rétabli entre le 5ème et le 10ème jour après la déplétion (Fig. 1a). Notamment, cette déplétion plaquettaire a entraîné une multiplication par 4 du nombre de Vwf+ LSKFlt3-CD48-CD150+ HSC de 2 jours, tandis que Vwf- Les CSH ont augmenté avec une cinétique plus lente après une réduction initiale (Fig. 1e). Par la suite, le Vwf+/Vwf- Le rapport HSC et les nombres absolus sont progressivement revenus à la normale, concomitamment à la normalisation du nombre de plaquettes (Fig. 1a, e). L'augmentation du Vwf+ Les HSC se sont également accompagnés d'une augmentation sélective du nombre de LSK Flt3-CD48+CD150+ sous-ensemble de MPP (Fig. 1b et Fig supplémentaire. 1b) montré comme étant biaisé par Mk22. De plus, les MkP23 ont également augmenté de manière significative quelques jours après l'augmentation du Vwf+ CSH, alors que les progéniteurs érythroïdes (Pre-CFU-E) et myéloïdes (GMP) n'étaient pas significativement affectés (Fig. 1c, d). Il convient de noter que malgré leur expression robuste de GPIbα et en accord avec le mécanisme indépendant du Fc par lequel l'anticorps conduit à une déplétion plaquettaire20, les MkP étaient initialement légèrement (mais pas significativement) réduites alors que les Mk n'étaient pas épuisées dans la BM par l'administration d'anticorps (Fig. 1j–g). Après l’activation initiale rapide, les CSH sont rapidement revenues au repos avec une distribution normalisée des phases du cycle cellulaire observée déjà 5 jours après la déplétion plaquettaire (Fig. 1c, d). Un anticorps monoclonal alternatif (NIT E)20 plaquettes épuisées et Vwf activé+ et VWF- Le cycle cellulaire des HSC est similaire à celui de l'anticorps anti-GPIbα (Fig. 2a, b). Le traitement par les anticorps GPIbα était accompagné d'une splénomégalie légère et transitoire avec un nombre accru de Vwf+ mais pas Vwf- CSH dans la rate (Fig. 2c, d).

Le recrutement de LSKFlt3 au repos-CD48-CD150+ La prolifération des cellules BM lors de l'activation et de l'épuisement aigus des plaquettes implique l'existence d'un mécanisme de rétroaction par lequel les CSH au repos sont recrutées pour rétablir l'homéostasie de Mk et des plaquettes. Afin de déterminer si les CSH de souris appauvries en plaquettes sont plus efficaces pour générer des Mks, nous avons utilisé un test de différenciation in vitro Mk/GM sur cellule unique. Clonogénicité d'un seul Vwf+ ou VWF- LSKFlt3-CD48-CD150+ Les CSH isolées de souris dans l'homéostasie (IgG) ou après une déplétion plaquettaire (GPIbα) étaient similaires (~ 80 % ; Fig. 2e). Cependant, un seul Vwf+ Les CSH isolées de souris appauvries en plaquettes se différencient plus rapidement en Mks qu'en Vwf- CSH de souris appauvries en plaquettes ou Vwf+ CSH isolées de souris en homéostasie (Fig. 1f) et a également généré un nombre plus élevé de colonies constituées exclusivement de Mks (Fig. 1g et Fig supplémentaire. 2f,g). Il a déjà été démontré que les progéniteurs de type tige engagés dans Mk et ressemblant phénotypiquement aux CSH prolifèrent en réponse à une thrombocytopénie induite par poly (I: C).24. Par conséquent, pour établir plus définitivement que LSKFlt3-CD48-CD150+ Les cellules BM induites à proliférer en réponse à la déplétion plaquettaire induite par l'anti-GPIbα comprennent de véritables CSH repeuplant à long terme. Nous avons utilisé des souris H2B-mCherry inductibles par la doxycycline (tet-ON).6,25. Dans ce système, une impulsion de traitement à la doxycycline entraîne l'incorporation d'histones marquées par mCherry dans les nucléosomes, qui se divisent également entre les cellules filles lorsque les cellules prolifèrent. En accord avec l'analyse du cycle cellulaire (Fig. 1c, d), la déplétion plaquettaire induite par les anti-GPIbα a entraîné une prolifération accrue des CSH, comme en témoigne la dilution accrue du marquage mCherry après 3 jours (Fig. 2h). Surtout, FACS a trié mCherrylo (prolifératif) LSKFlt3-CD48-CD150+ les cellules triées à partir de souris appauvries en plaquettes avaient un potentiel de reconstitution multilignée in vivo à long terme (LT ; 16 semaines) (Fig. 2i), démontrant que la déplétion plaquettaire induite par les anti-GPIbα recrute de puissantes LT-HSC dans la prolifération. Pour comparer plus directement Vwf+ Pour les CSH qui s'activent ou qui restent dans un état non proliférant suite à une déplétion plaquettaire, nous avons utilisé une méthode de marquage non invasive basée sur l'injection du dérivé de biotine N-hydroxyilsulfosuccinimide (Biotine), qui marque efficacement les protéines membranaires de toutes les cellules BM.26. Lorsque les cellules se divisent, les protéines membranaires marquées sont également réparties entre les cellules filles, permettant ainsi l'analyse de l'historique de la division cellulaire in vivo. De la même manière, pour le modèle H2B-mCherry, la déplétion plaquettaire a entraîné une réduction du marquage à la biotine du Vwf+ CSH (Fig. 1h) et aussi de Vwf- HSC (Fig. 2j). Les différences observées dans les analyses du cycle cellulaire et de la prolifération de Vwf- Les HSC pourraient potentiellement refléter la relation hiérarchique décrite précédemment entre Vwf+ et VWF- HSC9. Ainsi, la prolifération de Vwf+ Les HSC peuvent se différencier en Vwf- HCS, qui perpétue l’histoire de la dilution des étiquettes de biotine. Surtout, FACS a trié Vwf+Biotinelo (prolifératif) LSKFlt3-CD48-CD150+ cellules triées à partir de souris dépourvues de plaquettes (Fig. 2k, je) avait un potentiel de reconstitution multilignée in vivo à long terme (LT ; 16 semaines) (Fig. 1i), démontrant que la déplétion plaquettaire induite par les anti-GPIbα recrute de puissantes LT-HSC dans la prolifération. Bien qu'il reconstitue puissamment les plaquettes, aucun biais plaquettaire significatif n'a été observé du Vwf+ CSH proliférant en réponse à une déplétion plaquettaire, par rapport aux CSH non prolifératives (BiotineHi) VWF+ CSH (Fig. 1i). Quoi qu'il en soit, les deux fractions de biotine du Vwf+ Les CSH ont démontré une reconstitution similaire des LT-HSC (Fig. 1j) et étaient globalement tout aussi efficaces pour générer le Vwf+ et VWF- Compartiments HSC (Fig. 2m). Ceci est conforme au recrutement de LT-HSC fonctionnellement définies dans la prolifération et au fait que les proportions relatives de Vwf+ et VWF- Les CSH reviennent largement à la normale une fois l’homéostasie rétablie (Fig. 1b, e).

Reprogrammation transcriptionnelle de la niche HSC en réponse à une déplétion plaquettaire aiguë

L'existence d'un mécanisme de rétroaction par lequel les CSH au repos sont recrutées pour la prolifération en réponse à l'épuisement des plaquettes implique que les CSH de la BM doivent être capables de détecter la demande de production de plaquettes. Nous avons émis l’hypothèse que les cellules de niche stromales de la moelle osseuse pourraient être impliquées dans ce processus. En fait, des changements dans la niche de la BM après une déplétion plaquettaire ont déjà été suggérés.16,17 mais l'implication de cellules de niche spécifiques dans la régulation de la fonction des CSH dans ce contexte n'a pas été directement démontrée. Par conséquent, nous avons utilisé l'analyse globale du séquençage d'ARN de populations de cellules de niche de BM précédemment caractérisées ainsi que de CSH pour étudier les interactions moléculaires possibles entre ces cellules, impliquées dans la réponse des CSH à l'épuisement des plaquettes. Pour cela, des cellules non hématopoïétiques ont été isolées de deux27,28,29 régions anatomiques distinctes dans la BM : les cellules centrales de la BM (CBM) et les cellules de la muqueuse osseuse (BL) (Fig. 3a). Au sein du CD45-Ter119- cellules non hématopoïétiques dans les fractions BL et CBM, des populations de cellules de niche distinctes sont définies comme CD31Hi cellules endothéliales (EC) et CD31-Lépr+ cellules périvasculaires (PV). Dans la fraction BL, nous avons défini plus en détail CD31-Alcam-PDF+Échelle1+ (PαS) progéniteurs mésenchymateux, ainsi que CD31-Alcam-Échelle1-osx-GFP+ progéniteurs d'ostéoblastes (OBP) et CD31-Alcam+Échelle1- ostéoblastes (OB) (Fig. 2a, b). L'analyse cytométrique en flux de ces cellules isolées de souris en homéostasie et 1 jour après la déplétion plaquettaire n'a pas révélé de changements majeurs dans la composition cellulaire, hormis une augmentation faible mais significative du nombre de cellules CBM-PV (Fig. 2a, b). L'analyse du séquençage de l'ARN a montré un regroupement distinct des différentes populations endothéliales, mésenchymateuses et CSH (Fig. 3b). L'expression de marqueurs connus définissant les populations cellulaires de niche distinctes (Fig. 2c et données supplémentaires 1) et de différents régulateurs hématopoïétiques regroupés par modèle d'expression génique (Fig. 3c et données supplémentaires 1), ont en outre confirmé leurs identités cellulaires distinctes. De plus, l'analyse en composantes principales (ACP) des populations de cellules de niche a montré la séparation des cellules de la lignée endothéliale et mésenchymateuse le long de l'axe de la composante principale (PC) 1 et une séparation supplémentaire des populations mésenchymateuses le long de l'axe PC2 en fonction du stade de différenciation (Fig. 2d). L'analyse de l'expression différentielle des gènes, comparant les cellules de niche isolées de souris dans l'homéostasie et un jour après l'épuisement plaquettaire, a montré un nombre élevé de gènes différentiellement exprimés (DE) dans les cellules CBM-EC (1 gènes) et CBM-PV (266 gènes) (Fig. . 2e, f et données supplémentaires 2, 3). En revanche, un nombre beaucoup plus faible de gènes DE ont été détectés dans d’autres populations de niche, y compris les BL-EC et BL-PV associés aux os (Fig. 2e, f, Fig. Supplémentaire 3d, e et données supplémentaires 2-4), suggérant une implication préférentielle de la niche du CBM dans la réponse à la thrombocytopénie. L'analyse de l'ontologie génétique (GO) réalisée sur les gènes DE du CBM-EC a mis en évidence des processus biologiques associés à l'activation/coagulation plaquettaire (Pf4, Cléc1b, P2ry12), réponse au stress (Iftm3, Litaf, S100a4) et l'adhésion cellulaire (Vcam1, Ctgf) (Figue. 2g et données supplémentaires 5). L'analyse GO des gènes CBM-PV DE a révélé des processus biologiques associés à l'inflammation et en particulier à la réponse cellulaire à l'Interleukine-1 (IL-1) pro-inflammatoire (Fig. 2g et données supplémentaires 5). D'autres processus biologiques mis en évidence dans les cellules CBM-PV étaient la signalisation du récepteur Toll-like (TLR)-4, pour lequel les voies de signalisation en aval du récepteur sont partiellement partagées avec la signalisation de l'IL-1, ainsi que la différenciation mésenchymateuse et la signalisation du TGFβ (Vasn, Fst, Wisp2, Cyr61) (Figue. 2f,g).

Fig. 2 : Régulation positive d'une signature génétique pro-inflammatoire dans les cellules de niche de la moelle osseuse après une déplétion plaquettaire aiguë.
la figure 2

(En relation avec la Fig. 3). Analyse FACS et stratégies de contrôle pour le tri des cellules endothéliales et stromales dans la moelle osseuse centrale (CBM ; a) et la muqueuse osseuse (BL ; b) compartiments cellulaires de souris 1 jour après la déplétion plaquettaire (traitement aux anticorps GPIbα). Les souris témoins ont reçu un anticorps témoin isotype (IgG). Les diagrammes à barres représentent les fréquences moyennes ± SD (%) de chaque population cellulaire parmi les CD45 non hématopoïétiques totaux-Ter119- cellules. Les données proviennent de 3 souris par groupe sur 3 (a) et 2 (b) expériences indépendantes. *p < 0.05 ; ns non significatif (p > 0.05); évalué par un test t bilatéral. c-g Analyse de séquençage d'ARN des compartiments de cellules endothéliales/stromales de souris 1 jour après l'épuisement plaquettaire. c Expression (FPKM) de gènes caractérisant les différentes populations cellulaires de niche. d Analyse en composantes principales de l’expression génique normalisée des différentes populations cellulaires étudiées. e Nombre de gènes différentiellement exprimés (DE) entre les souris traitées aux IgG et aux GPIbα (ajusté p valeur (q)<0.05), dans chaque population de cellules de niche étudiée. f Parcelles de volcan et g termes d'ontologie des gènes (GO) analyse des gènes exprimés différentiellement dans les cellules endothéliales (EC) du CBM et dans le Lepr+ cellules périvasculaires (PV). Dans f, les points rouges indiquent de manière significative les gènes DE (q < 0.05. Pour tous les panels, les données représentent la moyenne ± SD FPKM de 3 répétitions biologiques provenant de 2 expériences indépendantes. Ostéoblastes OB, progéniteurs d'ostéoblastes OBP, PαS Pdfgrα+Échelle1+ progéniteurs mésenchymateux. Voir également la figure supplémentaire. 3.

La signalisation de l'IL-1 dans les cellules non hématopoïétiques est essentielle à la réponse des CSH à la déplétion plaquettaire

L'analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes (GSEA) a confirmé l'enrichissement des gènes liés à la réponse inflammatoire et à la signalisation du récepteur IL-1 observé dans les cellules CBM-PV isolées de souris traitées au GPIbα (Fig. 3a). Ces gènes comprenaient Il1rn (gène cible de l'IL-1 et antagoniste de la voie de signalisation de l'IL-1), Socs3 et Dusp1 (régulateurs de la voie de signalisation IL-1) et Fosb, Junb et Nfkbia (composants des voies activées en aval de la cascade de signalisation de l'IL-1) (Fig. 3b). Pour étudier plus en détail le rôle de l'inflammation stérile dans ce processus, nous avons analysé les niveaux de différentes cytokines pro-inflammatoires dans le liquide extracellulaire BM de souris traitées par GPIbα. Cette analyse a révélé une augmentation significative des taux d’IL-1α et d’IL-1β après la déplétion plaquettaire (Fig. 3c), avec une cinétique parallèle à l'expansion et à la normalisation ultérieure de Vwf+ HSC (Fig. 1e). Une augmentation initiale similaire a également été observée pour le TNFα, bien qu'elle se soit maintenue au-delà du moment où Vwf+ L'état du cycle cellulaire des CSH s'est normalisé (Fig. 4a). Les autres cytokines inflammatoires sont restées largement inchangées (IL-6 et IL-12) ou ont diminué à des stades ultérieurs (INFγ) après la déplétion plaquettaire (Fig. 4a). À l’état d’équilibre, il a été démontré que l’IL-1 est principalement produite par les cellules T circulantes (IL-1α) et les granulocytes (IL-1β).30. Dans nos ensembles de données analysant l'expression de l'IL-1, les deux Il1a et Il1b étaient pour la plupart indétectables dans les différentes populations de cellules de niche ainsi que dans les CSH (Fig. 4b), alors que les Mks primaires (Fig. 4c, d) a montré une forte expression, notamment de Il1a (Fig. 4b).

Fig. 3 : La signalisation hématopoïétique-extrinsèque de l'IL-1 est essentielle à l'activation des CSH biaisées en plaquettes en réponse à une déplétion plaquettaire aiguë.
la figure 3

(En relation avec la Fig. 5). a Analyse d'enrichissement des ensembles de gènes (GSEA) des données globales d'expression génique des cellules CBM-PV pour les ensembles de gènes indiqués. NES, score d'enrichissement normalisé (ou score échelonné). b Expression des gènes affiliés à la voie de signalisation IL-1 dans les cellules CBM-PV 1 jour après l'épuisement plaquettaire. Les données représentent la moyenne ± SD FPKM de 3 répétitions biologiques de 2 expériences indépendantes. **p < 0.01 ; *p < 0.05 (test t bilatéral). c Niveaux moyens ± écart-type d'IL-1α et d'IL-1β dans le liquide extracellulaire de la moelle osseuse isolé de souris aux moments indiqués après la déplétion plaquettaire (traitement aux anticorps GPIbα). Les souris témoins (jour 0) ont reçu un anticorps témoin isotype (IgG). Les données proviennent de 3 (Jour 0), 4 (Jour 1), 4 (Jour 2), 3 (Jour 3), 3 (Jour 5) et 3 (Jour 10) souris provenant de 4 expériences indépendantes. *p < 0.05 (ANOVA unidirectionnelle avec comparaisons multiples de Dunnett). d Analyse du cycle cellulaire de Vwf+ (à gauche) et Vwf- (à droite) CSH de souris 1 jour après l'administration intraveineuse des quantités indiquées d'IL-1β. Les données sont la moyenne ± écart-type de 3 souris recevant 0 ou 25 μg/Kg et de 4 souris recevant 50 μg/Kg d'IL-1β, dans 2 expériences indépendantes. Analyse du cycle cellulaire de Vwf+ (à gauche) et Vwf- (à droite) HSC de Wt et Il1r1- / - souris 1 jour (e) ou pour les HSC de Il1r1- / - souris aux moments indiqués (f) après une déplétion plaquettaire. e Moyenne ± SD données de 3 (IgG-Wt), 6 (IgG-Il1r1- / -) 7 (GPIbα -Wt) et 7 (GPIbα –Il1r1- / -) souris issues de 5 expériences indépendantes. f Fréquences moyennes ± SD de 6 (Jour0), 7 (Jour1), 3 (Jour3), 3 (Jour5) et 3 (Jour10) souris dans 4 expériences indépendantes. *p < 0.05 (par rapport à la même analyse de Wt Vwf+ et VWF- HSC sur la Fig. 1d). g, h Il1r1/Analyse de l’expression de l’IL-1R (h) au niveau de l'ARN par séquençage d'ARN (FPKM) dans Vwf+ et VWF- HSC et (i) au niveau protéique par cytométrie en flux dans des sous-ensembles de HSPC, isolés de souris en homéostasie ou 1 jour après l'épuisement plaquettaire. h Données moyennes ± SD FPKM de 3 répétitions biologiques par condition. i Données moyennes ± SD de l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) normalisées au MFI de la population cellulaire équivalente dans Il1r1- / - souris analysées dans le cadre de la même expérience. Les données proviennent de 5 souris par condition, dans 2 expériences indépendantes. i Analyse du cycle cellulaire de VWF-tdTomate+ CSH de souris avec suppression conditionnelle de Il1r1 dans toutes les cellules hématopoïétiques (Il1r1FL/FL Vav-CreTg/+) 1 jour après l'épuisement plaquettaire. Les contrôles incluent VWF-tdTomate+ HSC de Il1r1FL/+ Vav-CreTg/+, Il1r1+ / + Vav-CreTg/+ et wow-Cré+ / + souris (représentant des génotypes sans perte de fonction de l'IL-1R). Les données représentent les fréquences moyennes ± SD de 5 (contrôle-IgG), 5 (contrôle-GPIbα) et 4 (Il1r1FL/FL Vav-CreTg/+-GPIbα) souris issues de 3 expériences indépendantes. ***p <0.001; **p < 0.01 ; *p < 0.05 ; ns non significatif (p > 0.05); en utilisant le test t bilatéral (b, g, h) ou ANOVA bidirectionnelle avec les comparaisons multiples de Tukey (d-f, i). Voir également la figure supplémentaire. 4.

L'administration d'IL-1 recombinante à des souris a entraîné l'activation du cycle cellulaire de Vwf+ et VWF- CSH (Fig. 3d), avec Vwf+ Les CSH sont recrutées à un degré plus élevé dans la phase S-G2-M du cycle cellulaire (Fig. 4e), compatible avec l'IL-1 médiant l'activation des CSH en réponse à une thrombocytopénie induite par les anti-GPIbα. Pour étudier plus spécifiquement cette hypothèse, nous avons induit une déplétion plaquettaire chez des souris déficientes en IL-1R (Il1r1-/-), qui ont un compartiment HSC normal30 et un nombre normal de plaquettes. Surtout, Il1r1-/- les souris ont montré une réduction significative de la fréquence du cyclisme actif (S-G2-M) Vwf+ CSH après déplétion plaquettaire (Fig. 3e, f), par rapport aux souris de type sauvage (Wt) traitées au GPIbα. Le fait que Il1r1 le déficit n'a pas complètement aboli l'activation des CSH dans le cycle cellulaire en réponse au traitement par GPIbα, ce qui suggère que d'autres mécanismes (indépendants de l'IL-1) sont impliqués. En accord avec cela, nous avons précédemment montré une augmentation des taux de THPO dans le sérum 1 jour après la déplétion plaquettaire.9. Pour identifier d'autres signaux potentiellement en synergie avec l'IL-1 dans l'activation des CSH après l'épuisement plaquettaire, nous avons analysé l'expression de régulateurs de CSH connus, notamment Tgfb1 et Pf4, précédemment impliqué dans la quiescence des HSC31,32Et Fgf1, précédemment associé à la prolifération des CSH32. L'analyse du séquençage de l'ARN de populations de cellules de niche distinctes a révélé une régulation positive > 20 fois supérieure à Pf4 dans CBM-EC (Fig. 4f), alors qu'aucun changement dans l'expression de Tgfb1 et Fgf1 a été observé. Nous avons en outre étudié les niveaux de protéines de ces régulateurs dans le liquide extracellulaire de la BM après l'épuisement des plaquettes. Conformément à l'analyse de l'expression génique, les taux de TGFβ1 et de FGF1 n'ont pas été modifiés, mais le PF4 a augmenté de manière significative un jour après la déplétion plaquettaire médiée par GPIbα (Fig. 4g). Compte tenu du rôle précédemment décrit de PF4 dans l'induction de la quiescence des HSC31,33, il est peu probable que les taux accrus de PF4 observés dans le liquide extracellulaire de la BM expliquent l'activation de la prolifération des CSH après la déplétion plaquettaire.

Le séquençage de l'ARN a révélé de très faibles niveaux (≈1 FPKM) de Il1r1 transcriptions dans les HSC (Fig. 3g). L'analyse cytométrique en flux a montré des niveaux indétectables de protéine IL-1R sur les CSH et de faibles niveaux sur plusieurs sous-ensembles de MPP (Fig. 3h et Fig supplémentaire. 5a). En plus de l'absence d'expression détectable de l'IL-1R, aucun des gènes associés à la signalisation de l'IL-1 régulés positivement dans CBM-PV ne s'est révélé être régulé positivement dans Vwf.+ ou VWF- CSH après traitement par GPIbα (Fig. 5b). Bien que nous n'ayons pas observé d'expression détectable de l'IL-1R dans des CSH phénotypiquement définies, il a déjà été suggéré que l'IL-1 active les CSH.30. Par conséquent, pour déterminer si l’IL-1 peut intervenir directement dans l’activation des CSH après une thrombocytopénie induite par les anti-GPIbα, nous avons induit une déplétion plaquettaire chez Il1r1FL/FL wow-iCreTg/+ souris qui cible la suppression de Il1r1 à toutes les cellules hématopoïétiques, y compris les CSH. Analyse PCR numérique par gouttelettes de Vwf+ et VWF- Les HSC ont confirmé une efficacité de suppression supérieure à 99 % du Il1r1 allèles floxés par Vav-iCre dans les deux Vwf+ et VWF- Sous-ensembles HSC (Fig. 5c). Contrairement à ce que nous avons observé dans la lignée germinale Il1r1-/- souris (fig. 3e, f), Il1r1FL/FL wow-iCreTg/+ les souris ont montré une activation du cycle cellulaire induite par anti-GPIbα tout aussi efficace de Vwf+ HSC comme chez les souris Wt (Fig. 3i). Ensemble, ces résultats démontrent que la signalisation directe de l'IL-1R via les CSH ou d'autres cellules hématopoïétiques n'est pas impliquée dans l'activation distincte du cycle cellulaire des CSH en réponse à la déplétion plaquettaire et implique plutôt le rôle de la signalisation non hématopoïétique de l'IL-1 dans ce processus.

L'épuisement des plaquettes entraîne l'activation de la signalisation IL-1 dans les cellules périvasculaires

Nos études en Il1r1FL/FLwow-iCreTg/+Les souris et l'analyse du séquençage de l'ARN des cellules de niche BM suggèrent que la signalisation par l'IL-1 dans les cellules de niche, plutôt que dans les CSH ou d'autres cellules hématopoïétiques, pourrait jouer un rôle dans la rétroactivation des CSH après une déplétion plaquettaire. Parmi les cellules de niche, les cellules CBM-PV présentaient les niveaux de transcription les plus élevés de Il1r1 expressions (fig. 4a) et ont également montré une expression distincte de la protéine IL-1R, alors que toutes les autres populations de cellules stromales/endothéliales étaient pratiquement négatives pour l'expression détectable de la surface cellulaire de l'IL-1R (Fig. 4b). En fait, presque toute l’expression de l’IL-1R dans le CBM pourrait être attribuée à Lepr+ Cellules photovoltaïques (Fig. 4c), qui exprimait des niveaux plus élevés de régulateurs HSC critiques tels que Cxcl12 et Kitl, en comparaison avec l'IL-1R endostéale–/Lo Cellules BL-PV (Fig. 3c). Il est important de noter que la comparaison des gènes DE dans les cellules CBM-PV de Wt et Il1r1-/- des souris en homéostasie et après un traitement par GPIbα ont révélé que la majorité des gènes DE identifiés chez les souris Wt suite à une déplétion plaquettaire (Fig. 2f et 3b) n'étaient pas exprimés de manière différentielle dans les cellules CBM-PV provenant de cellules appauvries en plaquettes Il1r1-/- souris (fig. 4d), incluant les gènes directement associés à l'activation de la voie de signalisation de l'IL-1 (Fig. 4e). En plus des gènes liés à la signalisation de l'IL-1, nous avons trouvé des preuves d'une DE dépendante de l'IL-1R de voies impliquées dans la régulation extrinsèque de la prolifération des CSH, y compris la voie de signalisation du TGFβ (Fig. 2g et 4j, f, g)34. Cela comprenait une régulation à la hausse de Vasn (Vasorin), un inhibiteur direct de la signalisation TGFβ35 précédemment impliqué dans l’activation de HSC36. Autres gènes DE dépendants de l'IL-1R inclus Premier (Folistatine), un inhibiteur direct de la signalisation BMP/Activine37 et il a déjà été démontré qu'il inhibe la différenciation Mk à partir des cellules progénitrices hématopoïétiques38, et les gènes associés à l'adhésion cellulaire et à la liaison/régulation de l'intégrine (Fig. 2f,g et  4j–g).

Fig. 4 : L'expression d'IL1R définit une population de cellules stromales périvasculaires de la moelle osseuse impliquées dans la réponse des CSH à la déplétion plaquettaire.
la figure 4

a Analyse de séquençage d'ARN de Il1r1 expression génique (FPKM) dans différentes cellules de niche isolées de souris en homéostasie (traitées aux IgG) ou 1 jour après la déplétion plaquettaire (traitées par GPIbα). Données moyennes ± SD FPKM de 3 répétitions biologiques provenant de 2 expériences indépendantes. b, c Analyse cytométrique en flux de l'expression de l'IL-1R dans différentes populations de cellules endothéliales/stromales isolées de souris en homéostasie ou 1 jour après l'épuisement plaquettaire. Données moyennes ± SD de l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) normalisées au MFI de la population cellulaire équivalente dans Il1r1- / - souris analysées au sein de la même expérience (b). c Fréquence de la lèpre+ Cellules photovoltaïques au total IL-1R+ Cellules non hématopoïétiques CBM isolées de souris en homéostasie. Données de 4 (IgG) et 3 (GPIbα) souris dans 2 expériences indépendantes. d Analyse de séquençage d'ARN de cellules CBM-PV isolées de Il1r1+ / + et Il1r1- / - souris en homéostasie et après déplétion plaquettaire, pour l'expression de gènes sensibles au traitement CBM-PV-GPIbα. Données de 3 répétitions biologiques par condition. e Expression de gènes affiliés à la voie de signalisation IL-1 dans des cellules CBM-PV isolées de Il1r1- / - souris 1 jour après l’épuisement des plaquettes. Données moyennes ± SD FPKM de 3 répétitions biologiques par condition. GSEA des données globales d'expression génique pour l'ensemble de gènes indiqué (f) et expression (FPKM ; moyenne ± SD) des gènes indiqués (g), dans les cellules CBM-PV de type sauvage et Il1r1- / - souris en homéostasie et après déplétion plaquettaire. Données de 3 souris par condition. NES, score d'enrichissement normalisé (ou score échelonné). *p <0.05; **p < 0.01 ; ns, non significatif (p > 0.05); en utilisant le test t bilatéral (a, b, e) et ANOVA bidirectionnelle avec comparaisons multiples de Tukey'a (g).

La signalisation de l'IL-1 dans les cellules périvasculaires est essentielle à l'activation optimale de Vwf+ HSC

Étudier plus directement le rôle de la signalisation IL-1 dans les cellules CBM-PV dans l'activation de Vwf+ CSH en réponse à une thrombocytopénie, nous avons induit une déplétion plaquettaire chez la souris avec délétion conditionnelle de Il1r1 spécifiquement à Lepr+ Cellules photovoltaïques (Fig. 5d). Il1r1FL/FLLépr-CréTg/+ les souris ont montré une réduction significative du cycle actif (S-G2-M) Vwf+ CSH, en comparaison avec les souris témoins traitées par anti-GPIbα (Fig. 5a). La réduction de l'activation du cycle cellulaire était comparable à celle observée chez les lignées germinales supprimées. Il1r1-/- souris (fig. 3e, f), soutenant que Lepr+ Les cellules CBM-PV sont les principales cellules impliquées dans l'activation de Vwf dépendante de l'IL-1R+ CSH en réponse à la thrombocytopénie induite par les anti-GPIbα. Corroborant ces résultats, l'administration d'IL-1 recombinante à Il1r1FL/FLLépr-CréTg/+ les souris ont entraîné une réduction du recrutement de Vwf+ HSC en S-G2-M actif (Fig. 5b). De plus, la suppression spécifique de Il1r1 à Lépr+ Les cellules PV ont entraîné un retard léger mais significatif dans la récupération des plaquettes après la déplétion plaquettaire (Fig. 5c).

Fig. 5 : L'activation dépendante de l'IL-1 des cellules stromales périvasculaires de la moelle osseuse améliore l'activité Vwf + HSC en réponse à la déplétion plaquettaire.
la figure 5

(En relation avec la Fig. 6). a-c Analyse de souris avec suppression conditionnelle de Il1r1 à Lépr+ cellules périvasculaires (Il1r1FL/FL Lépreux-CreTg/+) souris après déplétion plaquettaire. Les contrôles incluent Il1r1FL/+ Lépreux-CreTg/+, Il1r1+ / + Lépreux-CreTg/+, Il1r1FL/FL Lépreux-CreTg/+ (IgG uniquement) et Lépr-Cré+ / + souris. a Analyse du cycle cellulaire de Vwf+ et VWF- CSH 1 jour après l'épuisement plaquettaire. Les données représentent les fréquences moyennes ± SD de 3 (contrôle-IgG), 5 (contrôle-GPIbα) et 5 (Il1r1FL/FL Lépreux-CreTg/+-GPIbα) souris issues de 3 expériences indépendantes. b Analyse du cycle cellulaire de Vwf+ et VWF- CSH de souris 1 jour après l'administration intraveineuse de 50 ug/kg d'IL-1β. Les données sont moyennes ± écart-type de 3 (contrôle-IgG), 6 (contrôle-GPIbα) et 4 (Il1r1FL/FL Lépreux-CreTg/+-GPIbα) souris issues de 3 expériences indépendantes. c Analyse du sang périphérique de la récupération des plaquettes aux moments indiqués après l'épuisement des plaquettes. Nombre moyen ± SD de plaquettes de 6 (témoin) et 11 (Il1r1FL/FL Lépreux-CreTg/+) souris dans 3 expériences indépendantes. d-g Analyse différentielle de l’expression génique dans Vwf+ et VWF- CSH isolées de souris de type sauvage 1 jour après la déplétion plaquettaire (traitement GPIbα). d Graphiques volcaniques de gènes exprimés différentiellement dans Vwf+ et VWF- HSC. Les points rouges indiquent les gènes présentant des différences d'expression significatives (ajustées p valeur (q)<0.05). e Diagramme de Venn montrant le nombre de gènes exprimés différentiellement dans Vwf+ et VWF- Les CSH post-épuisement plaquettaire et entre ces sous-ensembles de CSH dans l'homéostasie (IgG). f Analyse des termes GO des processus/voies biologiques régulés positivement dans Vwf+ CSH après déplétion plaquettaire. g Expression (FPKM) de gènes associés à la signalisation Activine/BMP dans Vwf+ et VWF- CSH de souris Wt en homéostasie et 1 jour après l'épuisement plaquettaire. Toutes les données (d-g) représentent les données moyennes ± SD FPKM de 3 répétitions biologiques par génotype et condition. *p <0.05; **p <0.01; ***p < 0.001 ; ns non significatif (p > 0.05); en utilisant l'ANOVA bidirectionnelle avec les comparaisons multiples de Tukey (a, b), ANOVA bidirectionnelle avec les comparaisons multiples de Sidak (c) et test t bilatéral (g). Voir également la figure supplémentaire. 5.

Pour mieux comprendre comment Vwf+ Les CSH sont recrutées dans la prolifération en réponse à la déplétion plaquettaire induite par l'anti-GPIbα. Nous avons effectué le séquençage de l'ARN de Vwf+ et VWF- HSC. Séquençage d'ARN de Vwf+ Les CSH ont identifié 230 gènes exprimés différentiellement après une déplétion plaquettaire, dont 170 étaient exclusivement exprimés différentiellement dans Vwf+ et pas Vwf- HSC, et 24 d'entre eux déjà distingués par Vwf+ et VWF- CSH dans l'homéostasie, y compris les gènes associés aux plaquettes/à la lignée Mk (Fig. 5d, e, Fig. Supplémentaire 5e, f et données supplémentaires 6, 7). Comparaison de Vwf+ et VWF- Les CSH de souris appauvries en plaquettes ont révélé un enrichissement des gènes d'activation du cycle cellulaire chez Vwf+ CSH, confirmant au niveau moléculaire l'activation préférentielle de Vwf+ CSH en réponse à la déplétion plaquettaire (Fig. 5g et données supplémentaires 8). Gènes différentiellement exprimés dans Vwf+ Les CSH après activation et déplétion plaquettaire sont principalement associées à la signalisation des intégrines et à l'adhésion cellulaire, connues pour être régulées par la signalisation TGFβ39, mais aussi le cycle cellulaire, la coagulation sanguine et la réponse au stress/inflammation (Fig. 5j–f). Bien que nous ne puissions pas exclure l'implication d'autres voies de signalisation dans la régulation de ces gènes, conformément à la régulation négative de Premier dans les cellules CBM-PV (Fig. 4g), les gènes cibles candidats Activin/BMP Exécuterx3 et Identifiant140 étaient respectivement régulés à la baisse et à la hausse chez Vwf+ mais pas Vwf- Les CSH post-épuisement plaquettaire (Fig. 5g). Il convient de noter le gène de l'α1,6-fucosyltransférase (fut8) qui régule différentiellement l'activité des récepteurs TGFβ et Activine41 et est également un régulateur de la signalisation des intégrines42 a été trouvé régulé positivement spécifiquement dans Vwf+ Les CSH post-épuisement plaquettaire. De plus, en réponse à la déplétion plaquettaire induite par les anti-GPIbα, Vwf+ HSC mais pas Vwf-HSC régulés positivement Fkbp1a, un régulateur intracellulaire de la signalisation Smad qui module l'intensité et la durée des signaux en aval des récepteurs TGFβ, Activin et BMP43,44 (Figue. 5g). Parallèlement à la régulation négative de Premier dans les cellules CBM-PV (Fig. 4g), ces données suggèrent qu'un passage de la signalisation TGFβ renforçant la quiescence à l'activation de la signalisation Activine/BMP pourrait entraîner des altérations de l'activité de l'intégrine, de l'adhésion cellulaire et de l'état du cycle cellulaire des CSH en réponse à l'activation et à l'épuisement aigus des plaquettes.

L'activation plaquettaire est essentielle pour la réponse des CSH à la déplétion plaquettaire

L'analyse de l'expression génique des CBM-EC a révélé plusieurs gènes régulés positivement lors de la déplétion plaquettaire qui sont associés à l'activation et à la coagulation des plaquettes (Fig. 2f,g). Ceci est conforme au mécanisme par lequel les plaquettes sont fréquemment consommées45, imité ici par la déplétion plaquettaire médiée par la GPIbα, qui fonctionne en induisant une activation plaquettaire indépendante du Fc, conduisant à la translocation de la sialidase neuraminidase-1 (NEU) plaquettaire vers la membrane, à la désialylation et à la clairance ultérieure dans le foie20. De plus, les plaquettes sont reconnues comme d’importants médiateurs de l’inflammation.46,47 et régulent rapidement à la hausse l’expression de la protéine IL-1 lors de son activation (Fig. 6a), comme l'ont déjà montré d'autres48,49,50. Cela confirme le rôle de l'activation plaquettaire et de la consommation ultérieure dans la médiation de l'activation dépendante de l'IL-1 observée ici de Vwf.+ CSH en réponse à la thrombocytopénie. Pour approfondir cette possibilité, nous avons traité des souris avec NEU51, qui, de la même manière que le traitement GPIbα (Fig. 1a) conduit à une déplétion plaquettaire efficace (Fig. 6b) mais contourne l'activation plaquettaire20. Alors que le traitement par GPIbα activait efficacement les plaquettes in vitro, comme mesuré par la coloration de surface à la P-sélectine (CD62P), le traitement in vitro par NEU n'entraînait qu'une très légère activation plaquettaire, et seulement à des concentrations élevées (Fig. 6c). L'activité NEU in vitro a cependant été confirmée par Ricinus communis Marquage de l'agglutinine I (RCA-1) (Fig. 6d), qui se lie spécifiquement aux protéines désialylées20. Malgré une diminution des plaquettes in vivo avec la même efficacité, contrairement au traitement anti-GPIbα, le traitement par NEU n'a pas entraîné d'activation du cycle cellulaire des CSH (Fig. 6e) et cela n'a pas non plus augmenté de manière significative le nombre de Vwf+ ou VWF- CSH (Fig. 6f), LSK Flt3-CD48+CD150+ MPP, pré-MegE et MkP dans BM (Fig. 6a, b). Il est à noter que chez les souris traitées au NEU, les niveaux d'IL-1α et d'IL-1β dans la BM sont restés largement inchangés (Fig. 6g). Ces résultats suggèrent que plutôt que la simple perte de plaquettes, la déplétion plaquettaire induite par l'activation anti-GPIbα est impliquée dans l'activation observée des CSH dépendante de l'IL-1. Des études antérieures impliquaient un rôle des Mks et de leurs facteurs sécrétés dans la régulation de la quiescence/prolifération des CSH31,32,33,52. Étant donné que Mks exprime également GPIbα, pour démontrer plus spécifiquement le rôle des plaquettes dans l'activation observée des CSH en réponse au traitement par anticorps anti-GPIbα, indépendamment de Mks, nous avons administré l'anticorps anti-GPIbα à des souris chez lesquelles les plaquettes avaient été efficacement appauvries en NEU. -traitement (fig. 6b), ce qui ne modifie pas le nombre de Mks33. Ce traitement séquentiel NEU-GPIbα a entraîné une réduction de l'activation du cycle cellulaire de Vwf+ CSH, par rapport au traitement par GPIbα seul (Fig. 6h), confirmant l'implication des plaquettes dans ce processus. Cependant, le fait qu'une certaine activation des CSH ait été observée chez les souris présentant un nombre de plaquettes appauvri en NEU, par rapport aux souris témoins présentant un nombre de plaquettes normal (Fig. 1d et 3e), soutient également le rôle de Mks dans l'activation observée des CSH en réponse au traitement par anticorps anti-GPIbα.

Fig. 6 : La déplétion plaquettaire médiée par la neuraminidase n'active pas les CSH.
la figure 6

(En relation avec la Fig. 4). a Expression de l'IL-1β dans les plaquettes au repos ou après activation in vitro (3h) avec de la thrombine ou de l'anticorps GPIbα. (À gauche), profils FACS représentatifs. Les nombres dans les graphiques sont des fréquences moyennes provenant de 3 expériences indépendantes. (À droite) Fréquence de l’IL-1β+ plaquettes; moyenne ± écart-type de 3 répétitions biologiques par condition dans 3 expériences indépendantes. Chaque réplique biologique est constituée de plaquettes provenant de 2 à 3 souris. b Analyse cinétique des lignées de cellules du sang périphérique après l'administration in vivo de Neuraminidase (NEU). Les données représentent la moyenne ± SEM de 10 (Jour0), 7 (Jour1), 8 (Jour2), 9 (Jour3), 6 (Jour5) et 3 (Jour10) souris provenant de 6 expériences indépendantes. Plaquettes PLT, globules blancs WBC, globules rouges RBC. c Expression de la sélectine P de surface (CD62P) sur les plaquettes mesurée par cytométrie en flux après incubation in vitro avec l'anticorps GPIbα ou NEU, aux concentrations indiquées. Les données représentent les changements de pli moyens ± SD de % CD62P+ cellules dans chaque condition par rapport aux plaquettes non traitées (au repos), de 7 (au repos), 6 (IgG), 3 (GPIbα-2,5ug), 7 (GPIbα-5ug), 7 (NEU 0.005U) et 6 (NEU 0.05U) souris dans 3 expériences indépendantes. d Activité de la neuraminidase (NEU) in vitro dans les plaquettes au repos ou après 30 minutes de traitement avec NEU, analysée par liaison RCA-1. Profil représentatif de 1 répétition biologique sur 3. Les chiffres indiquent la moyenne ± SD % de plaquettes RCA-1+. e Répartition moyenne ± SD des phases du cycle cellulaire de Vwf+ (à gauche) et Vwf- (à droite) CSH 1 jour après la déplétion plaquettaire avec NEU. Données de 6 souris par condition, dans 3 expériences indépendantes. f Évaluation basée sur FACS du compartiment HSC dans la moelle osseuse de souris aux moments indiqués après la déplétion plaquettaire avec NEU. Les données représentent des nombres absolus de VWF-GFP+ (VWF+) ou VWF-GFP- (VWF-) HSC (moyenne ± SEM) aux moments indiqués après l'épuisement des plaquettes. Les données proviennent de 5 (Jour0), 4 (Jour1), 5 (Jour2) et 6 (Jour3) souris dans 4 expériences indépendantes. Aucun changement significatif n'a été observé dans le nombre de Vwf+ ou VWF- HSC à tout moment. g Niveaux moyens ± SD (augmentation par rapport au jour 0) des cytokines indiquées dans le liquide extracellulaire de la moelle osseuse isolé de souris aux moments indiqués après l'épuisement plaquettaire avec la neuraminidase. Données de 3 souris par instant dans 2 expériences indépendantes. h Les souris ont été traitées avec NEU au jour 0, suivies d'une administration d'anticorps GPIbα au jour 2 et analysées au jour 3 (à gauche) pour déterminer la distribution des phases du cycle cellulaire dans Vwf.+ HSC (à droite). Les souris témoins ont été traitées uniquement avec l'anticorps GPIbα et analysées un jour plus tard. Les données représentent les fréquences moyennes ± SD de 1 souris par groupe dans 4 expériences indépendantes. i HSC dans S-G2-M dans Nbéal2- / - souris 1 jour après la déplétion plaquettaire (GPIbα). Les données représentent les fréquences cellulaires moyennes ± SD de 5 (Wt-IgG), 3 (Wt-GPIbα), 4 (Nbéal2- / --IgG) et 5 (Nbéal2- / --GPIbα) souris par condition issues de 3 expériences indépendantes. j Schéma décrivant le mécanisme de rétroaction proposé. Lors de leur consommation, les plaquettes activées sécrètent de l'IL-1, qui active les cellules PV exprimant l'IL-1R pour induire la prolifération et la différenciation des CSH vers la lignée plaquettaire. Comme indiqué, Mks peut également contribuer au recrutement décrit de CSH dans la prolifération en réponse à un traitement avec l'anticorps anti-GPIbα, entraînant une déplétion plaquettaire dépendante de l'activation. Pour toutes les données ***p <0.001; **p < 0.01 ; *p < 0.05 (indiqué uniquement pour les différences significatives) en utilisant l'ANOVA unidirectionnelle avec les comparaisons multiples de Tukey (a, c, f, i), ANOVA bidirectionnelle avec les comparaisons multiples de Sidak (e, h) ou les comparaisons multiples de Dunnett (g); ns non significatif. Voir également la figure supplémentaire. 6.

Les plaquettes stockent plusieurs modulateurs inflammatoires dans les granules plaquettaires, qui sont libérés lors de l'activation plaquettaire53,54. Pour étudier plus en détail si la libération du contenu des granules plaquettaires est nécessaire pour l'activation des CSH médiée par la GPIbα, nous avons induit une déplétion plaquettaire (traitement par la GPIbα) chez des souris déficientes en Nbéal2 (Nbéal2-/-), dépourvus de granules α plaquettaires55. Nbéal2-/- les souris ont une hématopoïèse globalement normale malgré une légère diminution du nombre de plaquettes et une légère augmentation des CSH (Fig. 6c-e). Un jour après le traitement anti-GPIbα Nbéal2-/- les souris présentaient une fréquence significativement réduite de CSH en cycle actif par rapport aux souris Wt, malgré une fréquence plus élevée de CSH en cycle avant le traitement (Fig. 6i). Ensemble, ces résultats suggèrent que l'IL-1 et d'autres régulateurs sécrétés lors de l'activation plaquettaire pourraient jouer un rôle dans la régulation de l'activation des CSH en réponse à la thrombocytopénie.

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