Monsieur le rédacteur,

Le paraquat est un herbicide toxique qui peut provoquer de graves lésions pulmonaires, entraînant la mort des cellules épithéliales alvéolaires, une fibrose pulmonaire ultérieure et une insuffisance respiratoire. Comprendre les processus de réparation suite à une blessure au paraquat est essentiel pour développer des stratégies thérapeutiques potentielles pour traiter les patients empoisonnés au paraquat. Cependant, le programme de réparation des poumons lésés par le paraquat est actuellement inconnu. Dans cette étude, nous avons analysé des échantillons de parenchyme pulmonaire provenant d'une patiente de 18 ans qui avait ingéré du paraquat et qui avait ensuite subi une double transplantation pulmonaire le 34e jour après son empoisonnement.¹.

Les analyses histologiques ont révélé que la structure alvéolaire était gravement perturbée par la toxicité du paraquat. Les expériences d'immunocoloration ont démontré l'absence de PDPN⁺ cellules épithéliales alvéolaires de type 1 (AT1) et une diminution spectaculaire de la proSPC⁺ cellules épithéliales alvéolaires de type 2 (AT2) dans le poumon lésé par le paraquat (Fig. 1a; Fig. supplémentaire. S1a). Au lieu de cela, ces zones étaient remplies d'α-SMA⁺ myofibroblastes (Fig. 1a). Le proSPC survivant⁺ Les cellules AT2 étaient principalement regroupées à la périphérie du poumon lésé par le paraquat, avec quelques-unes dispersées autour des voies respiratoires distales (Fig. S1a,b). Pour étudier les programmes de réparation dans le poumon gravement blessé, nous avons effectué des analyses de séquençage d’ARN unicellulaire (scRNA-seq). Suite à un pipeline de contrôle qualité intégré, nous avons obtenu une collection complète de 19,171 XNUMX transcriptomes, qui ont été annotés en quatre grands groupes de types de cellules : EPCAM⁺ cellules épithéliales (n = 4120), DCN⁺ cellules stromales (n = 2491), PTPRC⁺ cellules immunitaires (n = 10,431), et CDH5⁺ cellules endotheliales (n = 2129) (Fig. S2a). Sur la base de marqueurs canoniques de lignée et de signatures moléculaires distinctes de types de cellules individuelles, nous avons identifié un total de 45 types/états de cellules dans le poumon lésé par le paraquat (Fig. S2b–e et tableaux S1S2).

a Analyse de l'hématoxyline et de l'éosine (H&E) (panneau supérieur) et immunomarquage (panneau inférieur) pour le proSPC (marqueur cellulaire AT2), le PDPN (marqueur cellulaire AT1) et l'α-SMA (marqueur myofibroblastique) d'un poumon sain et d'un poumon lésé par le paraquat . Barre d'échelle, 100 μm. b Intégration par approximation et projection uniforme du collecteur (UMAP) des cellules épithéliales dans le poumon lésé par le paraquat et annotation de la sous-population. c Proportions relatives de chaque type de cellules épithéliales dérivées de b. d Immunocoloration pour KRT5 (marqueur de cellules basales), SCGB1A1 (marqueur de cellules en club et en gobelet), MUC5AC (marqueur de cellules en gobelet) et α-Ac-Tubuline (marqueur de cellules ciliées) du poumon sain et du poumon lésé par le paraquat. Les cosses en nid d'abeilles autour des voies respiratoires distales du poumon blessé par le paraquat ont été agrandies sur les panneaux de droite. Barre d'échelle, 100 μm. e Coloration complète du poumon lésé par le paraquat à l'aide d'anticorps contre KRT5 et α-SMA. Les structures de gousses en nid d'abeilles entières agrandies sont illustrées dans e″. La section Z dans e‴ montre que KRT5⁺ les cellules des pods sont connectées à KRT5⁺ cellules basales dans les voies respiratoires. Barre d'échelle dans e', 500 µm ; Barres d'échelle dans e″ ainsi que e‴, 100 µm. f Immunocoloration du poumon lésé par le paraquat à l'aide d'anticorps contre KRT5, SERPINB3 et CLCA2 (marqueurs cellulaires basaux différenciateurs). L'encart dans le coin inférieur gauche montre une image agrandie de la région de la boîte en pointillés blancs. Barre d'échelle, 100 μm. g Transition grossière et dirigée des cellules épithéliales dans le poumon lésé par le paraquat par CellRank. Heatmap représente les probabilités moyennes d’absorption de chaque cellule dans les types de cellules donnés jusqu’aux destins terminaux. h Analyse de trajectoire pseudo-temporelle calculée à partir de l'intégration UMAP de cellules épithéliales dans b par la vitesse de l’ARN. Les flèches indiquent les trajectoires de lignée prévues. i Score de signalisation NOTCH dans EPCAM⁺ cellules épithéliales du poumon lésé par le paraquat projetées sur l'UMAP s'incrustant dans b. j Immunocoloration du poumon blessé par le paraquat à l'aide d'anticorps contre KRT5, HIF1A et HES1. L'encart dans le coin inférieur gauche montre une image agrandie de la région de la boîte en pointillés blancs. Barre d'échelle, 100 μm. k Score de signalisation d'hypoxie-HIF1A dans toutes les cellules du poumon lésé par le paraquat projeté sur l'intégration UMAP dans la Fig supplémentaire. S2b. l Immunocoloration du poumon blessé par le paraquat à l'aide d'anticorps contre proSPC, HIF1A et HES1. La ligne pointillée blanche indique la périphérie du poumon. Barre d'échelle, 100 μm.

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Analyse de regroupement impartiale de EPCAM⁺ Les cellules épithéliales ont révélé dix sous-populations distinctes (Fig. 1b). Conformément aux résultats de l'immunocoloration, il n'y avait pas PDPN⁺ Population de cellules AT1, indiquant une perte totale d'unités d'échange gazeux dans le poumon lésé par le paraquat. Ces dix sous-populations comprenaient SFTPC⁺ Cellules AT2 et neuf sous-populations de cellules épithéliales des voies respiratoires, ces dernières comprenant sept types de cellules classiquement définis (basales, MUC5AC^Élevée gobelet, SAA^Élevée gobelet, SCGB1A1^faible cellules neuroendocrines caliciformes, massues, ciliées et pulmonaires) et deux états intermédiaires (cellules basales différenciées et cellules massues différenciées) (Fig. 1b; Fig. supplémentaire. S3a). Les cellules basales différenciées exprimaient les deux marqueurs cellulaires basaux (KRT5 ainsi que KRT15) et les marqueurs de cellules caliciformes (SERPINB3, SERPINB4et CLCA2)² (Fig. S3a), indiquant qu’ils sont les progéniteurs des cellules caliciformes. Les cellules club différenciées nouvellement identifiées expriment des marqueurs des deux cellules club (SCGB3A2 ainsi que SCGB1A1) et les cellules caliciformes (MUC5B) (Fig. S3a). Étant donné que les cellules caliciformes sont reconnues comme un type de cellule différenciée en phase terminale, les cellules club en différenciation peuvent représenter une étape intermédiaire entre la différenciation des cellules club et des cellules caliciformes.

Dans les poumons d'un donneur sain, EPCAM⁺ Les cellules épithéliales sont constituées à la fois de cellules épithéliales alvéolaires (cellules AT1 et AT2) et de cellules épithéliales des voies respiratoires, les cellules épithéliales alvéolaires représentant plus de 40 % des cellules épithéliales alvéolaires. EPCAM⁺ population^3,4. Cependant, dans le poumon lésé par le paraquat, la proportion de cellules épithéliales alvéolaires (la population de cellules AT2) a diminué de manière significative jusqu'à 9.4 %, tandis que la proportion de cellules épithéliales des voies respiratoires a augmenté jusqu'à 90.6 % (Fig. 1c). Plus précisément, les proportions de cellules souches/progénitrices des voies respiratoires, y compris les cellules basales (27.4 %), les cellules club (17.5 %), les cellules basales différenciées (7.4 %) et les cellules club différenciées (4.7 %), ont été significativement augmentées (Fig. 1c). Ces résultats suggèrent que le poumon blessé par le paraquat subit un programme actif de réparation des voies respiratoires mais un programme de réparation alvéolaire inadéquat.

Pour étudier la distribution de l'augmentation des cellules épithéliales des voies respiratoires dans le poumon lésé par le paraquat, nous avons effectué des analyses d'immunocoloration. Semblables au poumon sain, les cellules épithéliales pseudostratifiées des voies respiratoires distales du poumon lésé par le paraquat étaient constituées de KRT5.⁺ cellules basales, SCGB1A1⁺MUB5AC^- cellules club et α-Ac-tubuline⁺ cellules ciliées (Fig. 1d). Cependant, nous avons observé des accumulations de mucus et des cellules épithéliales desquamées obstruant la lumière des voies respiratoires dans le poumon blessé par le paraquat. De plus, nous avons observé de nombreuses structures en forme de « gousse en nid d’abeille » situées dans les régions alvéolaires autour des voies respiratoires distales, qui n’étaient pas observées dans le poumon sain (Fig. 1d). Les cellules épithéliales prédominantes dans les gousses en nid d'abeille étaient positives pour KRT5 (Fig. 1d). Par coloration complète, nous avons en outre constaté que ces KRT5⁺ les cellules épithéliales en nid d'abeille maintenaient toujours un lien étroit avec le KRT5⁺ cellules épithéliales des voies respiratoires distales (Fig. 1e; Vidéos supplémentaires S1S2). La plupart des KRT5⁺ les cellules épithéliales des gousses en nid d'abeille expriment fortement les marqueurs des cellules basales différenciées, SERPINB3 et CLCA2 (Fig. 1f). Ces résultats suggèrent que les cellules basales des voies respiratoires distales donnent naissance à des cellules basales différenciées et forment des gousses anormales en nid d'abeilles dans le poumon lésé par le paraquat.

Des études antérieures ont montré que les cellules souches/progénitrices des voies respiratoires reconstituent non seulement les cellules épithéliales perdues des voies respiratoires, mais participent également au programme de réparation alvéolaire ectopique après des lésions pulmonaires.^5,6,7,8. Pour mieux élucider les relations de lignée entre les cellules souches et progénitrices des voies respiratoires dans le contexte de lésions pulmonaires graves induites par le paraquat, nous avons utilisé des analyses de vitesse d'ARN et de CellRank. Nos analyses ont révélé que les cellules basales possèdent une plus grande propension à donner naissance à des cellules basales différenciées (Fig. 1g, h). Les cellules club peuvent se différencier en cellules caliciformes grâce aux cellules club en différenciation, confirmant l'idée selon laquelle les cellules club différenciées représentent une étape intermédiaire reliant les cellules club aux cellules caliciformes (Fig. 1g, h). Des études antérieures utilisant des modèles murins de lésions pulmonaires ont indiqué que les cellules progénitrices des voies respiratoires peuvent se différencier en cellules AT2 et AT1.^5,6,7. Cependant, nos analyses ont montré des probabilités limitées de différenciation des cellules basales, des cellules basales et des cellules club en cellules AT2 dans le poumon lésé par le paraquat (Fig. 1g, h). En revanche, les cellules AT2 du poumon lésé par le paraquat présentent une plus forte propension à se différencier en cellules club. Collectivement, ces résultats suggèrent que les cellules AT2 et les cellules souches/progénitrices des voies respiratoires dans le poumon lésé par le paraquat présentent une capacité considérablement réduite à régénérer l'épithélium alvéolaire, conduisant finalement à une perte irréversible d'unités d'échange gazeux.

Pour explorer la voie de régulation sous-jacente à la réparation aberrante des cellules souches/progénitrices des voies respiratoires vers l'épithélium alvéolaire, nous avons comparé l'expression génique dans la différenciation des cellules basales dans les poumons d'un donneur sain.⁹ et le poumon blessé par le paraquat. Nous avons constaté que les gènes impliqués dans la régulation de la signalisation NOTCH et dans les réponses des espèces réactives de l'oxygène sont fortement régulés positivement dans le poumon lésé par le paraquat (Fig. 1i; Fig. supplémentaire. S3b). Expression de HES1 ainsi que HÉ1, les gènes cibles de la signalisation NOTCH, ont été significativement augmentés, soutenant l'activation de la signalisation NOTCH dans les cellules basales en différenciation (Fig. 1i,j; Fig. supplémentaire. S3c). Étant donné que les espèces réactives de l'oxygène ont été impliquées dans la réponse hypoxique¹⁰, nous avons en outre analysé l'expression du facteur 1 alpha inductible par l'hypoxie (HIF1A), une caractéristique bien connue de l'hypoxie.¹¹. L'analyse d'immunocoloration a démontré que la majorité des cellules basales en nid d'abeille étaient positives pour HIF1A (Fig. 1j), indiquant l'activation de la signalisation induite par l'hypoxie dans ces cellules basales différenciées. Notamment, HES1 est également fortement exprimé dans la plupart des HIF1A.⁺ cellules basales en nid d'abeille (Fig. 1j). Ces résultats concordent avec une étude précédente rapportant que l'hypoxie peut activer la signalisation NOTCH et bloquer la différenciation des cellules progénitrices des voies respiratoires en cellules épithéliales alvéolaires dans les poumons blessés par le virus de la grippe H1N1.¹². Pris ensemble, nos résultats indiquent que l'activation de la signalisation NOTCH induite par l'hypoxie dans les cellules basales en différenciation entraîne une diminution de la capacité à générer des cellules épithéliales alvéolaires dans le poumon lésé par le paraquat.

Augmentation significative de HIF1A⁺ Les cellules et leur large répartition dans les poumons lésés par le paraquat ont indiqué que le microenvironnement pulmonaire pourrait être extrêmement hypoxique. En effet, en plus de différencier les cellules basales, d’autres types de cellules, notamment les cellules basales, les cellules AT2, les monocytes, les macrophages, les neutrophiles et les myofibroblastes, présentaient généralement des scores d’hypoxie élevés (Fig. 1k). HIF1A⁺ Des cellules AT2 ont également été observées à la périphérie du poumon lésé par le paraquat, et certaines cellules AT2 co-exprimaient HES1 (Fig. 1l), suggérant que la signalisation NOTCH induite par l'hypoxie était également activée dans les cellules AT2. Il a été démontré que l'activation soutenue de la signalisation NOTCH inhibe la différenciation des cellules AT2 en AT1 dans les poumons de souris¹³. Nous pensons que l'activation de la signalisation NOTCH induite par l'hypoxie dans les cellules AT2 pourrait altérer la différenciation des cellules AT2 en cellules AT1 lors de la réparation alvéolaire dans ce poumon blessé par le paraquat.

Dans cette étude, nous avons démontré expérimentalement que les programmes de régénération épithéliale dans les poumons lésés par le paraquat sont perturbés. La mort cellulaire massive après un empoisonnement au paraquat entraîne une infiltration significative des cellules immunitaires, une perte d'unités d'échange gazeux et une fibrose pulmonaire (Fig. S2b), entraînant un microenvironnement hypoxique étendu dans les tissus pulmonaires. Ce microenvironnement peut contribuer aux programmes de réparation aberrants en activant la signalisation NOTCH et en perturbant la différenciation des cellules souches/progénitrices des voies respiratoires et des alvéoles, ce qui exacerbe les lésions des tissus pulmonaires. Nos résultats suggèrent que la transplantation pulmonaire pourrait être le seul traitement viable pour les patients présentant une intoxication grave au paraquat. Il est important de noter que notre étude met en évidence le rôle crucial d’un microenvironnement approprié dans la régénération des unités alvéolaires fonctionnelles, qui dépend de la différenciation des cellules AT1 nouvellement formées. L’hypoxie étant une caractéristique courante des maladies pulmonaires graves, les futures stratégies thérapeutiques ciblant le microenvironnement pulmonaire hypoxique, telles que la réduction de l’hypoxie ou l’inhibition de la signalisation NOTCH, pourraient être prometteuses pour le traitement des lésions pulmonaires graves.