Stratégie de conception informatique

Des boucles courtes pour connecter les hélices pRO-2.3 en une seule chaîne ont été conçues à l'aide d'une base de données exhaustive d'échantillons de squelette composés de fragments s'étendant sur deux régions hélicoïdales identifiées par DSSP dans des structures cristallographiques à haute résolution (comme décrit précédemment).¹⁴). Les boucles ont été identifiées dans cette base de données via un alignement rigide des résidus terminaux du fragment et de la cible à l'aide d'un algorithme de superposition optimisé¹⁵. Les candidats qui répondaient à une tolérance d'alignement de 0.35, XNUMX Å RMSD ont été alignés sur le squelette cible via des coordonnées d'espace de torsion et des contraintes de coordonnées souples sur les coordonnées des atomes lourds du squelette candidat alignés. Les séquences de boucles candidates ont ensuite été conçues sous des contraintes de profil de séquence générées via l'alignement du squelette de boucle sur la base de données de structure source. Les candidats ayant obtenu les scores les plus bas ont été sélectionnés pour la conception finale de la boucle.

Méthodes d'amarrage et de conception hélicoïdales⁷ ont été appliqués au pRO-2.3 lié pour générer des modèles de conception de filaments hélicoïdaux. Les critères suivants ont filtré les trajectoires de conception individuelles : un écart supérieur à −15.0 unités d'énergie Rosetta entre les états lié (polymère) et non lié (monomère), une surface d'interface supérieure à 700 Å.², une complémentarité de forme Rosetta supérieure à 0.62 et un nombre de résidus polaires insatisfaits inférieur à 5. Les conceptions satisfaisant à ces critères ont été affinées manuellement, impliquant des réversions en un seul point vers des mutations jugées non contributives à la stabilisation de l'état lié de l'interface. La conception la mieux notée pour chaque configuration ancrée a ensuite été intégrée dans un ensemble de protéines finalisé pour validation expérimentale.

Expression et purification de protéines

Les gènes synthétiques d'un total de 18 modèles ont été optimisés pour l'expression dans Escherichia coli et acquis auprès d'IDT, puis inséré dans le site de clonage multiple du vecteur pET29b+ entre les sites de restriction NdeI et XhoI. Ces constructions ont été introduites dans BL21* (DE3) E. coli cellules compétentes. Les transformants ont été cultivés dans 50 ml de milieu Terrific Broth additionné de 200 mg l^-1 kanamycine. L'expression, sous le contrôle d'un promoteur T7, s'est déroulée pendant 24 h à 37 ° C par autoinduction Studier.¹⁶ jusqu'à ce que les cultures soient récoltées par centrifugation. Les culots cellulaires ont été remis en suspension dans une solution saline tamponnée Tris (TBS) et lysés avec un détergent Bugbuster. La fraction soluble, clarifiée par centrifugation, a subi une purification via Ni²⁺ chromatographie d'affinité sur métal immobilisé en utilisant la résine Ni-NTA Superflow. La résine avec le lysat cellulaire lié a été lavée avec dix volumes de colonne d'imidazole 40 mM et de NaCl 500 mM, suivi d'une élution avec de l'imidazole 400 mM et du NaCl 75 mM. Les fractions solubles et insolubles ont été soumises à une analyse par électrophorèse sur gel SDS – Polyacrylamide. Des échantillons présentant des bandes protéiques au poids moléculaire correct ont été choisis pour le criblage par microscopie électronique. Les modèles sélectionnés ont été mis à l'échelle jusqu'à 0.5 l pour une caractérisation plus approfondie, l'expression se poursuivant à nouveau pendant 24 h à 37 ° C en utilisant l'autoinduction Studier.¹⁶ avant récolte par centrifugation. Les culots cellulaires ont été remis en suspension dans du TBS et lysés par microfluidisation, suivi d'une purification comme décrit ci-dessus.

Tache négative EM

Les fractions solubles ont été concentrées dans du TBS (tampon Tris 25 mM, NaCl 75 mM, pH 8) pour un dépistage par microscopie électronique. Une gouttelette de 6 µl (un échantillon de 1 µl dilué instantanément avec 5 µl de tampon) a été appliquée sur des grilles en cuivre de 200 mesh à décharge luminescente négative, recouvertes de carbone, lavées avec de l'eau Milli-Q et colorées à l'aide de formiate d'uranyle à 0.75 % (pH 4.0). ) ou Nano-W (pH 6.8) acheté auprès de Nanoprobes, Inc. comme décrit précédemment¹⁷. Le dépistage a été effectué à l'aide d'un microscope électronique à transmission (FEI) Morgagni M100 de 268 kV ou d'un microscope électronique à transmission Talos L120C de 120 kV (ThermoFisher). Les images ont été capturées à l'aide d'un système de caméra Teitz CMOS 4k à montage inférieur et traitées pour un contraste amélioré à l'aide du logiciel Fidji (version : 2.14.0/1.54f).¹⁸ pour plus de clarté.

Les longueurs de fibres ont été quantifiées à l'aide de l'algorithme de traçage des fibres dans cryoSPARC⁸. Cette méthode identifie les fibres par corrélation croisée avec une classe de modèle et en traçant les fibres contiguës à partir des particules identifiées. Une classe de modèles générée à partir de DpHF19 a été utilisée pour toutes les fibres mesurées. Les fibres ont été filtrées selon la courbure moyenne (<0.0005 Å^-1) et la corrélation croisée normalisée moyenne (> 0.5) sur chaque fibre. Pour DpHF18, nous avons utilisé 5, 2, 3, 20, 28 et 21 images pour pH 3, 3.5, 4.2, 5, 8 et 3 à 8, respectivement. Pour DpHF19, nous avons utilisé 7, 8, 8, 28, 4 et 5 images pour pH 3, 3.5, 4.2, 5, 8 et 3 à 8, respectivement. Pour DpHF19_9his, nous avons utilisé 6, 6, 8, 14, 15, 8 et 4 images pour pH 3, 3.5, 4.2, 5, 6, 8 et 3 à 8, respectivement.

Cryo-EM

Les échantillons Cryo-EM ont été préparés en appliquant des protéines sur des grilles de carbone trouées CFLAT, en épongeant le liquide et en plongeant les grilles dans de l'éthane liquide à l'aide d'un Vitrobot (ThermoFisher). Pour DpHF19, les vidéos ont été acquises sur un microscope Glacios (ThermoFisher) équipé d'une caméra K-2 Summit Direct Detect (Gatan Inc.) fonctionnant en mode comptage, avec une taille de pixel de 1.16 Å par pixel, 50 images et une dose totale d'électrons. de 65 Å^-2. Pour DpHF18 et DpHF7, les vidéos ont été acquises sur un Titan Krios (ThermoFisher) équipé d'une caméra K-2 Summit Direct Detect (Gatan Inc.) fonctionnant en mode super-résolution, avec une taille de pixel de 0.525 Å par pixel, 50 images et une dose électronique totale de 90 Å^-2. La collecte automatisée des données a été réalisée à l'aide de Leginon¹⁹ version 3.4. Le traitement des données a été effectué à l'aide de cryoSPARC⁸, et les flux de travail sont résumés dans les figures supplémentaires. 10-12. Les vidéos ont été alignées par correction de mouvement par patch, avec des vidéos en super résolution regroupées à une taille de pixel de 1.05 Å. Les paramètres de la fonction de transfert de contraste (CTF) ont été estimés à l'aide du patch CTF. Le traçage des filaments sans modèle a été effectué sur un sous-ensemble d'images et les particules résultantes ont été soumises à une classification 2D. Les classes 2D sélectionnées ont ensuite été utilisées comme modèles pour le traçage de filaments basé sur des modèles sur des ensembles de données complets. Après plusieurs cycles de classification 2D, les particules sélectionnées ont été soumises à un raffinement 3D avec une symétrie hélicoïdale imposée et un raffinement non uniforme activé. Pour DpHF19, nous avons imposé une symétrie hélicoïdale à un départ reliant des sous-unités individuelles sans contact, plutôt que les paramètres de symétrie hélicoïdale à deux départs. Pour DpHF7 et DpHF19, la défocalisation par particule, l'inclinaison du faisceau et l'aberration sphérique ont également été affinées. La modification de la densité a été réalisée à l'aide de ResolveCryoEM dans Phenix^20,21 version phénix-1.20.1. Les modèles atomiques pour DpHF18 et DpHF19 ont été affinés en cartes cryo-EM à l'aide d'ISOLDE²², suivi d'un raffinement en espace réel dans Phenix, avec les contraintes Rotamer et Ramachandran désactivées et avec les contraintes de référence imposées par le modèle de départ d'entrée. L'élucidation du modèle pour DpHF7 a utilisé le protocole de construction de modèle de novo sur la densité unitaire asymétrique segmentée cryo-EM²³. L'incorporation et le raffinement ultérieurs des résidus ont été réalisés à l'aide de RosettaCM²⁴ version 2019.31, tirant parti de la symétrie sur la carte cryo-EM non segmentée pour un ajustement optimal à la densité et aux interfaces intra-filament. Un dernier cycle de raffinement dans l'espace réel a été effectué dans Phenix, comme décrit ci-dessus pour DpHF18 et DpHF19. Les statistiques de collecte, de raffinement et de validation des données Cryo-EM sont résumées dans le tableau supplémentaire. 1.

TIRFM

Assemblage de fibres

Pour imager la nucléation ensemencée de fibres sensibles au pH, les fibres DpHF18 ont été marquées avec deux fluorophores différents conjugués au maléimide, Oregon488 et sulfo-Cy5. Les fibres ont été marquées avec un excès molaire de 10 fois, dans du PBS + 1 mM de TCEP pendant 4 h à température ambiante, avant échange de tampon dans du TBS (Tris 25 mM, NaCl 100 mM, pH 8.0) sur une colonne de centrifugation Zeba et concentration à 30 µM. . Les fibres vertes à 30 µM ont été désassemblées par addition de citrate 1 M (0.6 µl de citrate pour 20 µl de fibres) pour réduire le pH à 3.0. La solution a été incubée pendant 5 min avant l'ajout de Tris (3.6 µl de stock 1 M) pour ramener le pH à 8.0 ; 1 µl de fibres assemblées DpHF18 – Cy5 à 30 µM a été ajouté à la solution. La solution a ensuite été incubée à température ambiante avant centrifugation à 13,000 XNUMX g pendant 2 min dans une centrifugeuse de paillasse. Les fibres ont été remises en suspension dans du TBS et imagées par TIRFM.

Démontage des fibres

L'imagerie TIRFM rapide du désassemblage des fibres à faible pH a été réalisée sur un système TIRF sur mesure basé sur un support Nikon Ti équipé d'un système de mise au point parfaite ainsi que d'un système de mise au point rapide. Z platine piézo (ASI), un illuminateur TIRF azimutal (iLas2, Roper France) avec un champ de vision étendu personnalisé (Cairn) et un objectif PLAN Apo 1.45 NA ×100. Les images ont été acquises avec une caméra sCMOS rétro-éclairée Photometrics Prime 95B fonctionnant en mode d'obturation pseudo global, synchronisée avec l'éclairage azimutal. Le système était exploité par Metamorph 7.10.1.161. Les fibres marquées au maléimide Sulfo-Cy5 ont été imagées avec un laser de 630 nm (OBIS cohérent de 150 mW monté dans un lancement laser Cairn) et imagées à l'aide d'un filtre Chroma ET655lp monté dans une roue Cairn Optospin à une fréquence d'images de 1 image toutes les 16 ms.

Les fibres ont été imagées dans un tampon d'imagerie (Tris 25 mM pH 8.0, NaCl 100 mM) dans une Flow Cell Ibidi montée sur des lamelles de qualité salle blanche (personnalisées, 25 × 75 mm).², Nexterion), et passivé avec PLL-PEG (0.1 mg ml^-1 dans Hepes 20 mM, pH 7.6 ; 5 minutes). Les fibres ont pu se déposer sur la lamelle pendant 5 minutes avant que les fibres non liées ne soient retirées avec le tampon d'imagerie. Lors d'une acquisition rapide, le pH a été réduit en faisant couler un tampon à faible pH (Tris 25 mM, NaCl 100 mM, pH 3.0).

Pour mesurer le désassemblage des fibres dans une solution en vrac, des fibres préformées dans des tubes Eppendorf de 1.5, 96 ml ont été échangées dans des tampons citrate à un pH inférieur pour stimuler le désassemblage. Une partie de chaque réaction de pH a été retirée à différents moments et ajoutée à une plaque à 10 puits pendant 2500 minutes pour permettre aux fibres de se déposer et d'adhérer au substrat en verre. Pour chaque condition et point temporel, neuf champs de vision ont été acquis sur un microscope IN Cell Analyser 60HS (Molecular Devices) à l'aide d'un objectif aérien Nikon ×0.95 PLAN Apo 631 NA et d'une source d'excitation LED de 150 nm, temps d'exposition de 684 ms avec émission collectée. à travers un filtre passe-bande de 24 ± XNUMX nm. Les images ont été quantifiées à l'aide d'un script CellProfiler personnalisé pour segmenter les fibres avec l'algorithme de seuillage Otsu.²⁵. Les limites supérieure et inférieure du seuil, ainsi que la fenêtre adaptative pour l'identification des objets, ont été ajustées jusqu'à ce que les fibres soient correctement identifiées par rapport au signal de fond. La longueur du grand axe des objets identifiés à l'aide du pipeline CellProfiler a été tracée en fonction du temps d'incubation pour chaque condition de pH.

AFM en phase liquide

Répartition des échantillons

Nous avons incubé 10 µl d'une solution de poly-lysine à 0.01% en poids sur une surface de mica muscovite fraîchement clivée (12 mm, Ted Pella Inc.) pendant 2 min. L'excès de solution a été éliminé et la surface a été rincée à l'eau et séchée avec N₂ gaz⁷. Ensuite, 30 µl de solution protéique à 10 µM dans le tampon d’imagerie (Tris-HCl 25 mM, NaCl 400 mM à pH 8) ont été incubés sur le mica recouvert de polylysine pendant 30 min et lavés avec le tampon d’image pour éliminer l’excès de protéine. Le pH du tampon de démontage (Tris-HCl 25 mM, NaCl 400 mM, pH 4.1, 4.4, 4, 5 ou 4.7) a été ajusté avec du NaOH 10 M ou de l'acide citrique 1 M et filtré avec un filtre PVDF de 0.1 µm de taille de pores avant utilisation. . Pour les expériences photoacides, une solution de protéine 10 µM dans du Tris-HCl 25 mM pH 8 a été incubée sur du mica nu pendant 30 min et lavée avec du Tris-HCl 25 mM pH 5.5 ; une étape supplémentaire de dépôt et de rinçage était réalisée si la densité numérique des fibres en surface était faible. Nous avons également fraîchement préparé du 1-nitrobenzaldéhyde 2 mM (Sigma-Aldrich) dans du Tris-HCl 25 mM pH 5.5 et l'avons immédiatement utilisé sans exposition à la lumière à aucun moment.²⁶. Les mesures spectroscopiques et du pH ont indiqué que le 2-nitrobenzaldéhyde est activable entre des longueurs d'onde de 200 et 405 nm et abaisse le pH de 5.5 à 2.7, et qu'une intensité laser plus élevée entraîne une consommation et une acidification plus rapides.

Imagerie

Pour l'étude cinétique à composition constante, les substrats de mica poly-lysine recouverts de protéines ont été placés sous la cellule liquide AFM (Bruker Multimode8). Les images ont été capturées dans le tampon d'imagerie à l'aide d'un cantilever en nitrure de silicium propre (Bruker, SNL-10, constante de ressort : 0.12 N·m^-1, ozoné UV pendant 5 min) en mode tapotement à température ambiante (25 °C). Avant de faire circuler le tampon de démontage, les fibres ont été imagées en continu pendant 10 minutes afin d'optimiser les paramètres (256 lignes de balayage, fréquence de balayage de 1.5, 3 Hz, gain intégral élevé (4–50) et amplitude libre de 100 à 25 mV). Après avoir confirmé qu'aucun dommage induit par le porte-à-faux ne s'est produit, le tampon de démontage a été injecté en continu à raison de XNUMX µl min.^-1. La configuration à flux continu a été optimisée pour fournir un temps de séjour négligeable et une commutation rapide du pH.¹⁰.

Pour l'étude des photoacides, du mica recouvert de protéines avec 25 mM de Tris-HCl pH 5.5 a été placé sous la cellule liquide d'un Cypher VRS AFM (Asylum Research) équipé d'un laser BlueDrive (filtre d'intensité × 0.3, longueur d'onde de 405 nm) avec la valve de ventilation. ouvert et exploité en mode taraudage. Après avoir confirmé la couverture de surface élevée des fibres, le tampon d'imagerie a été remplacé par 1 mM de 2-nitrobenzaldéhyde dans 25 mM de Tris-HCl pH 5.5, utilisé sans exposition à la lumière de fond visible et à nouveau imagé. Le porte-à-faux a ensuite été rétracté et BlueDrive a été activé et quadrillé à plusieurs reprises sur des zones présélectionnées à l'aide du microscope optique motorisé de l'AFM. La durée totale d'exposition aux UV pendant la trame/le maintien pour les motifs de points et de lignes n'était pas supérieure à 10 minutes, après quoi le porte-à-faux a été ramené vers les zones exposées et imagé. Pour les changements globaux de pH, la fenêtre de quartz de la cellule liquide AFM en contact avec la solution photoacide a été exposée à une lampe UV portative (longueur d'onde de 364 nm) pendant 7 min, puis imagée.

Les images ont été traitées avec le logiciel d'analyse de données Gwyddion SPM v2.62 et analysées avec le logiciel Fiji v1.53s.¹⁸. Pour la cinétique, la longueur totale des fibres a été mesurée et tous les fragments considérés comme déjà démontés ont été exclus de la mesure de longueur. Pour mesurer le taux de démontage à chaque extrémité des fibres individuelles (Fig. 8), le centre de la fibre (la moitié de la longueur initiale) a été attribué comme deuxième extrémité pour mesurer la longueur, tandis que pour les fragments de fibre, le centre du fragment a été mesuré comme deuxième extrémité.

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• La source: https://www.nature.com/articles/s41565-024-01641-1