Aislamiento de criptas y cultivo de organoides.

Aislamiento de cripta de RCCHan™: el duodeno de rata hembra WIST y el cultivo de organoides se realizaron de acuerdo con el informe anterior²¹. Las criptas se aislaron utilizando el reactivo de disociación celular suave (STEMCELL Technologies) durante 30 minutos en hielo. El contenido digerido se filtró a través de un colador de 70 µm y se centrifugó a 300 ×g durante 5 min a 4°C. Los sedimentos se resuspendieron con Advanced DMEM/F-12 enfriado con hielo y se centrifugaron a 150X.g durante 2 min a 4°C. La fracción de criptas se incrustó con Matrigel 100 % (factor de crecimiento reducido, Corning, Cat# 356231) en el medio basal, que consistía en DMEM/F-12 avanzado, penicilina/estreptomicina (Thermo Fisher Scientific), HEPES 10 mM (Thermo Fisher Scientific ), GlutaMAX-I 2 mM (Thermo Fisher Scientific) suplementado con 1 × Suplemento B-27 (Thermo Fisher Scientific), 1 mM N-acetilcisteína, gastrina 10 nM (Sigma-Aldrich), 100 ng/ml de noggin de ratón recombinante (Peprotech), 50 ng/ml de EGF de ratón recombinante (Thermo Fisher Scientific), 100 ng/ml de IGF-1 humano recombinante (BioLegend) , 50 ng/ml de FGF básico humano recombinante (FGF-2) (Reprocell), 1 µg/ml de R-espondina 1 humana recombinante (FUJIFILM Wako Pure Chemical), A500-83 01 nM y Afamina/Wnt10a CM al 3 % (JSR) . Los organoides de tipo gemación fueron recogidos y pasados ​​mediante interrupción mecánica. Se complementó Y-10 27632 µM durante los primeros 2 días de cultivo hasta el primer pase, y se eliminó el EGF del primer pase. Los organoides de rata se mantuvieron en medio ΔE, que consiste en medio basal suplementado con 1 × suplemento B-27, 1 mM. N-acetilcisteína, gastrina 10 nM, 100 ng/ml Noggin, 100 ng/ml IGF-1, 50 ng/ml bFGF humano recombinante termoestable (Thermo Fisher Scientific), 1 o 0.5 μg/ml R-espondina 1, 500 nM A83-01 y 10 % de Afamina/Wnt3a CM. Para el cultivo en monocapa, los organoides de rata se disociaron con TrypLE Select Enzyme (10x) durante 5 minutos en un baño de agua a 37 °C y se filtraron a través de un filtro celular de 70 µm. El filtrado se centrifugó a 300×g durante 3 minutos a 4 °C y se descartó el sobrenadante, y las células individuales se resuspendieron con medio ΔE suplementado con 50 ng/ml de EGF y Y-10 27632 µM. 100 µL de suspensión celular (7.0 × 10⁴ células/pocillo) se añadió en un inserto de cultivo celular (Corning, Cat#353095) recubierto con Matrigel diluido 30 veces con PBS durante al menos 2 h a 37 °C. Y-27632 se complementó con medio de cultivo sólo el primer día. Las imágenes de campo brillante se obtuvieron con un microscopio invertido (IX83, Olympus).

Desarrollo de organoides enriquecidos con quistes.

Los organoides de rata se disociaron con TrypLE Select Enzyme (10 ×) durante 5 minutos en un baño de agua a 37 ° C y se filtraron a través de un colador celular de 70 µm. Las células individuales se resuspendieron con medio enriquecido con quistes que consistía en medio basal suplementado con 1 × suplemento B-27, 1 mM. N-acetilcisteína, gastrina 10 nM, noggin 100 ng/ml, EGF 50 ng/ml, IGF-100 1 ng/ml, bFGF termoestable 50 ng/ml, R-espondina 0.5 1 µg/ml, A500 83 nM 01, Y-10 27632 µM y Afamina/Wnt20a CM al 3 %. 3.0 × 10⁴ Las células se incluyeron con 50 µl de Matrigel y se cultivaron con medio enriquecido con quistes. El medio se reemplazó cada 2 o 3 días y los organoides enriquecidos con quistes se pasaron cada 3 o 4 días mediante disociación mecánica.

cultivo monocapa

Los organoides convencionales/organoides enriquecidos con quistes se disociaron en células individuales utilizando TrypLE Select Enzyme (10x). Después de una filtración con un filtro celular de 70 µm y una centrifugación, el sedimento celular se resuspendió en medio enriquecido con quistes y se ajustó a 3.5 x 10⁵ células/mL. Se sembraron 200 µl de suspensión celular en Transwell (Corning, Cat#3378 o 3470) recubierto con Matrigel diluido 50 veces con PBS frío a 37 °C durante 2 h, y se añadió medio al compartimento basal. El día 2 o 3, el medio se cambió al medio de diferenciación que consistía en medio basal que contenía 1 × Suplemento B-27, 1 mM. N-acetil-cisteína, gastrina 10 nM, noggin 100 ng/ml, R-espondina 0.5 1 µg/ml, A500-83 01 nM, Y-10 27632 µM, VPA 3 mM (Abcam). El medio se reemplazó cada 2 o 3 días. Para el ensayo de inducción, se expuso medio de diferenciación que contenía β-naftoflavona 50 µM (Sigma), 5-metilcolantreno 3 µM (Sigma) o 100α, 1-dihidroxivitamina D25 3 nM (Sigma) durante 48 h. La actividad de CYP1A y la actividad de CYP3A se analizaron mediante ensayos P450-Glo según el protocolo del fabricante (luciferina-CEE para CYP1A, luciferina-IPA para CYP3A, Promega). La integridad de la monocapa se evaluó mediante TEER. El valor TEER se midió utilizando el sistema Millicell ERS-2 (Merck).

Examen histológico

Se preparó un bloque de parafina de organoides de rata mediante el método descrito anteriormente.⁴⁷. Brevemente, los organoides de rata se fijaron con glutaraldehído al 4% durante 1 hora a temperatura ambiente. La cúpula de Matrigel se rompió mediante pipeteo y se recogió, luego se incrustó en parafina mediante el método AMeX.⁴⁸. Se prepararon portaobjetos HE y se realizó un AB-PAS.

Inmunotinción de montaje completo para organoides y monocapa.

Después de retirar el medio de cultivo, el domo Matrigel se fijó con paraformaldehído (PFA) al 2% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado con PBS, se añadió PBS que contenía Triton X-0.5 al 100 % y se permeabilizó a 4 °C durante la noche. El bloqueo se realizó con la solución de bloqueo BlockAid (Thermo Fisher Scientific) que contenía Triton X-0.5 al 100% durante 6 h a temperatura ambiente. Anticuerpos primarios [anticuerpo anti-Ki-555 marcado con Alexa Fluor 67 (clon B56, BD Biosciences), anticuerpo anti-Sox9 (clon D8G8H, tecnología de señalización celular), anticuerpo anti-CK20 (clon SA35-03, Thermo Fisher Scientific), anticuerpo anti-P-gp (clon F4, Thermo Fisher Scientific), anticuerpo anti-ZO-1 (clon ZO1-1A12, Thermo Fisher Scientific) y anticuerpo anti-fosfo-Ezrin (clon 48G2, Cell Signaling Technology)] en el bloqueo Se añadió una solución que contenía Triton X-0.5 al 100% y se incubó durante 3 días a 4 °C. Después de eso, la muestra se lavó con PBS que contenía Triton X-0.5 al 100% tres veces, se incubó durante 1 o 2 días a 4 °C con un anticuerpo secundario [anticuerpo IgG anti-conejo marcado con Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific), Alexa Anticuerpo IgG anti-conejo marcado con Fluor Plus 555 (Thermo Fisher Scientific) o anticuerpo IgG555 anti-ratón marcado con Alexa Fluor 1 (Thermo Fisher Scientific)] en una solución de bloqueo que contiene Triton X-0.5 al 100 %. Después de lavar tres veces con PBS que contenía Triton X-0.5 al 100 %, los pocillos se incubaron con la solución 2 SeeDB1G [1/3 x Omnipaque350 con saponina al 2 %] durante 3 h a temperatura ambiente, la solución 2 (1/2 x Omnipaque350 con 2 % de saponina) que contiene Phalloidin-DyLight 650 y 1 µg/mL de DAPI durante la noche a 4 °C, Solución 3 (1 × Omnipaque350) durante 3 h a temperatura ambiente para eliminar los organoides⁴⁹, que se observaron con un microscopio de fluorescencia confocal (A1, Nikon).

Para el cultivo en monocapa, después de retirar el medio de cultivo, la monocapa se fijó con PFA al 4% durante 15 min a temperatura ambiente. Después del lavado con PBS, se añadió una solución de bloqueo que contenía Triton X-0.5 al 100% y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. La monocapa se tiñó con anticuerpos primarios [anticuerpo anti-P-gp, anticuerpo anti-ZO-1, anticuerpo anti-fosfo-Ezrin, anticuerpo anti-E cadherina (Thermo Fisher Scientific, PA5-32178), anticuerpo anti-Villin-1 ( Clon R814, tecnología de señalización celular)] en una solución de bloqueo que contiene Triton X-0.3 al 100 % a 4 °C durante 2 días, luego se lavó con PBS tres veces, se incubó durante la noche a 4 °C con un anticuerpo secundario en una solución de bloqueo que contenía Triton X al 0.3 % -100.

Microscopía electrónica de transmisión para organoides.

Los organoides se fijaron con media solución de Karnovsky a 4 °C durante 24 h. Los organoides fijados con Matrigel se trituraron en trozos de aproximadamente 1 mm.³ con una hoja de afeitar y se lavó con tampón de cacodilato 0.1 M. La fijación adicional se realizó utilizando tetróxido de osmio al 1% en tampón cacodilato 0.1 M a 4 °C durante 1.5 h. Los organoides fijados se deshidrataron mientras se aumentaba gradualmente la concentración de etanol del 50 al 100%, se reemplazaron con óxido de propileno y se incluyeron en resina epoxi (Quetol812, Nisshin EM). La resina se polimerizó térmicamente; Se prepararon secciones ultrafinas (60–70 nm) utilizando un ultramicrótomo (Leica EM UC7, Leica Microsystems), se tiñeron doblemente con acetato de uranilo y citrato de plomo y se observaron con un microscopio electrónico de transmisión (HT7700, Hitachi High-Technologies).

Ensayo de formación de organoides.

Los organoides convencionales y los organoides enriquecidos con quistes se disociaron en células individuales de la misma manera que en el cultivo en monocapa. Estas células se incluyeron con Matrigel y se cultivaron en medio de expansión suplementado con Y-10 27632 μM durante 4 días. El crecimiento organoide se midió utilizando CellTiter-Glo.^® Ensayo de viabilidad celular 3D (Promega) después de solubilizar Matrigel con dispasa (Dispasa I, FUJIFILM Wako Pure Chemical). Para el análisis de imágenes se realizó con cellSens (OLYMPUS) según el fabricante. Se definió que la formación de un organoide se producía cuando se midió que el eje principal de su estructura superaba los 100 μm en la imagen de campo brillante.

Ensayo de absorción de EdU

La tinción con EdU se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante (kit de proliferación celular Click-iT Plus EdU para imágenes, colorante Alexa Fluor 555, Thermo Fisher Scientific). Los núcleos y las células positivas para EdU se contaron utilizando elementos NIS (Nikon) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

RT-PCR cuantitativa

El ARN total se extrajo del cultivo en monocapa utilizando TRIzol. El ADNc se sintetizó con el sistema de síntesis de primera cadena Superscript III para RT-PCR (Thermo Fisher Scientific). La RT-PCR cuantitativa se realizó por duplicado para cada gen en el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Thermo Fisher Scientific) utilizando SYBR Green (Thermo Fisher Scientific). b-Actina fue utilizado como gen de limpieza. Las secuencias de los cebadores para RT-PCR se muestran en la tabla complementaria S1.

Ensayo de permeabilidad compuesta.

Para el ensayo de permeabilidad del amarillo de Lucifer, se añadió en el lado apical un tampón transportador que consta de HEPES 10 mM y BSA al 1% (p/v) en HBSS (pH 7.4) con amarillo de Lucifer 200 μM. HBSS se adquirió de Thermo Fisher Scientific (n.° de cat. 14025092). También se añadió el tampón transportador sin amarillo de lucifer al lado basal y se cultivó agitando. Después de 2 h, se tomaron muestras del tampón basal para su análisis. La concentración de amarillo Lucifer se determinó mediante una señal fluorescente medida con EnSpire (PerkinElmer) utilizando filtros de excitación de 428 nm y de emisión de 536 nm. Para el ensayo de permeabilidad de digoxina, se añadió un tampón transportador que contenía amarillo de lucifer 200 μM y digoxina 10 μM en presencia o ausencia de Zosuqudar 5 μM en el lado apical o basal, respectivamente. Después de 2 h, se tomaron muestras del tampón basal o apical para su análisis. Para el ensayo metabólico de midazolam, se añadió HBSS que contenía amarillo de lucifer 200 µM, midazolam 5 µM, MES 10 mM y BSA al 1 % (p/v) (pH 6.5) en presencia o ausencia de ABT 1 mM en el lado apical de la monocapa diferenciada. Se añadió tampón transportador que consistía en HEPES 10 mM y BSA al 4% (p/v) en HBSS (pH 7.4) al lado basal de la monocapa. Después de 2 h, se tomaron muestras del tampón basal para su análisis. Para el ensayo de midazolam se utilizó la monocapa que se cultivó durante 3 días en medio de expansión y durante 4 días en medio diferenciado con inducción de VD100 3 nM durante 48 h. La concentración de digoxina y 1-hidroximidazolam se determinó mediante análisis LC-MS/MS. El coeficiente de permeabilidad aparente (Papp) se calculó según la siguiente ecuación:

donde dQ/dt representa el compuesto transportado al lado basal o apical por unidad de tiempo, A es el área de superficie del inserto de cultivo celular y C₀ es la concentración inicial del compuesto.

Análisis LC-MS/MS

Las muestras de tampón recolectadas se mezclaron con metanol/acetonitrilo (1/1, v/v) que contenía un estándar interno (d3-digoxina para el análisis de digoxina, d4-1-hidroximidazolam por 1-hidroximidazolam). Después de la centrifugación o filtración, el sobrenadante se analizó utilizando el sistema Nexera X3 (Shimadzu), el sistema QTRAP6500 (SCIEX) y la columna ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7 μm, 2.1 mm × 50 mm, Waters) para digoxina, o el XBridge BEH C18. Columna (3.5 μm, 2.1 mm × 100 mm, Waters) para 1-hidroximidazolam.

análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 7.04 (software GraphPad) mediante la prueba t de Student y la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Un valor de p <0.05 se consideró estadísticamente significativo.

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• Fuente: https://www.nature.com/articles/s41598-023-39425-7