Η ακολουθία επόμενης γενιάς (NGS) σημαίνει αλληλουχία υψηλής απόδοσης με μαζικά παράλληλο τρόπο που έφερε τεράστιο αντίκτυπο σε πολύ χαμηλότερο κόστος χρησιμοποιώντας μια ποικιλία νέων τεχνολογιών πλατφόρμας. Με την εξαιρετικά υψηλή απόδοση, επεκτασιμότητα και ταχύτητα, το NGS επιτρέπει πολλές εφαρμογές που απαιτούν αλληλουχίες DNA και / ή RNA. Οι εφαρμογές περιλαμβάνουν αλληλουχία ολόκληρου-γονιδιώματος (WGS) οργανισμών που έχουν πολλαπλά, μεγάλα χρωμοσώματα που απαιτούν εξελιγμένους αλγόριθμους για συναρμολόγηση αλληλουχίας, ανάλυση χρονικών και χωρικών προτύπων έκφρασης RNA, σχολιασμός νέων γονιδιωμάτων και των κωδικοποιημένων γονιδίων τους χρησιμοποιώντας βιοπληροφορικά εργαλεία, μελέτες επιγενετικές μεταβολές στα γονιδιώματα, και αναλύσεις πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου και γενετικών υπογραφών που είτε προβλέπουν ευαισθησία γενετικής νόσου είτε την παρουσία επιθυμητών γενετικών χαρακτηριστικών. Το NGS παρέχει επίσης βαθιές γνώσεις για τη βιολογική ποικιλομορφία και την εξελικτική ιστορία των πληθυσμών, είτε προέρχονται από ιική, μικροβιακή, φυτική ή ανθρώπινη προέλευση.
Η πρώτη γενιά τεχνολογιών προσδιορισμού αλληλουχίας DNA που αναπτύχθηκε από τους Sanger και από
Ο Maxam και ο Gilbert στα τέλη της δεκαετίας του 1970 οδήγησαν στους αυτοματοποιημένους ακολουθίες DNA που αναπτύχθηκαν από το Εφαρμοσμένα όργανα βιοσυστήματος (ΑΒΙ), η οποία συνδύασε τη χημεία τερματισμού αλυσίδας διδεοξυνουκλεοτιδίων του Sanger με αντιδραστήρια φθορίζοντος τερματιστή βαφής για προσδιορισμό αλληλουχίας απλής αντίδρασης, αντί να χρησιμοποιεί τις συνηθισμένες τέσσερις ξεχωριστές αντιδράσεις για την παρακολούθηση της ενσωμάτωσης νουκλεοτιδίων Α, Ο, Ο ή Τ κατά τη διάρκεια της σύνθεσης DNA. Έκτοτε, πολλαπλά κύματα (δεύτερη, τρίτη και τώρα τέταρτη γενιά) τεχνολογιών πλατφόρμας οδήγησαν σε αυτό που είναι σήμερα γνωστό ως NGS.
Η λέξη Next in NGS σημαίνει το τεχνολογικό άλμα που πραγματοποιείται μεταξύ κάθε γενιάς. Το πιο κουραστικό βήμα της κλωνοποίησης στην αλληλούχιση πρώτης γενιάς εξαλείφθηκε εξ ολοκλήρου αντικαθιστώντας το με μαζικά παράλληλη αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) εκατοντάδων εκατομμυρίων σύντομων θραυσμάτων DNA. Παραδείγματα τεχνολογιών πλατφόρμας που χρησιμοποιούνται σε όργανα δεύτερης γενιάς περιλαμβάνουν πυροσυσχέτιση (Roche 454), αναστρέψιμο τερματισμό (Illumina), απολίνωση (Αλληλουχία με Oligonucleotide Ligation and Detection or SOLiD) (Life Technologies and Applied Biosystems Inc), nanoball / ligation (Complete Genomics and BGI Shenzhen) και ανίχνευση ιόντων (Ion Torrent).
Η τρίτη γενιά απαλλάχθηκε εντελώς από το βήμα ενίσχυσης πιέζοντας αργά μακρά μόρια DNA μέσω μοριακών πόρων, όπως η μέτρηση σφαιριδίων. Οι μηχανές τρίτης γενιάς ενσωμάτωσαν την τεχνολογία μονού μορίου σε πραγματικό χρόνο (κύτταρο SMRT) (Pacific Biosciences) και τον προσδιορισμό αλληλουχίας νανοπόρων μεμονωμένων μορίων (Oxford Nanopore Technologies). Η τεχνολογία τέταρτης γενιάς, που μερικές φορές ονομάζεται in situ sequencing, στοχεύει στην αποφυγή της προετοιμασίας δείγματος εντελώς και προσπαθεί να διατηρήσει τη χωρική θέση των αλληλουχιών RNA και DNA σε υποκυτταρική ανάλυση, επιτρέποντας έτσι τη χαρτογράφηση των αναγνωστικών αλληλουχιών σε αυτές τις τοποθεσίες.
Οι τεχνολογίες NGS στοιχηματίζουν σε παράλληλες εξελίξεις στην υπολογιστική ικανότητα να χειρίζονται και να εξάγουν πληροφορίες από τεράστιες ποσότητες περιττών και κατακερματισμένων δεδομένων ακολουθίας. Η επιτυχία του NGS ενισχύθηκε επομένως από παράλληλες εξελίξεις στο cloud computing, τα εργαλεία οπτικοποίησης και τους αλγόριθμους βιοπληροφορικής. Για παράδειγμα, στην εποχή του COVID-19, αυτές οι καινοτομίες επέτρεψαν στους επιστήμονες να αναζητήσουν απαντήσεις σε νέα βιολογικά ζητήματα όπως η προέλευση του SARS-CoV-2, πώς έχει εξαπλωθεί σε όλο τον κόσμο, το ποσοστό μετάλλαξής του σε πραγματικό χρόνο, πώς σχετίζεται με άλλους κοροναϊούς και πώς εξελίσσεται καθώς εξαπλώνεται σε όλο τον κόσμο, μέσα σε εβδομάδες έως μερικούς μήνες από το ξέσπασμα.
Οι παράλληλες εξελίξεις στα εργαλεία τεχνολογίας NGS, cloud computing και CRISPR-Cas9, όταν συνδυάζονται με πλεόνασμα ποιοτικών δεδομένων, έχουν δημιουργήσει μια τέλεια καταιγίδα για την καινοτομία πολλών διαφορετικών εφαρμογών που μπορούν να μεταφράσουν τα οφέλη του NGS σε κοινωνικές αιτίες.
Οι ποικίλες εφαρμογές που δημιουργούνται από το NGS έχουν τη δυνατότητα να επηρεάσουν κάθε πτυχή της ανθρώπινης υγείας, τόσο εντός όσο και εκτός ιατρικής πρακτικής. Επιπλέον, το NGS φέρνει ήδη επανάσταση στη γεωργική παραγωγικότητα και βοηθά στην αξιολόγηση των ρόλων των μικροβίων του εντέρου, του αέρα, του νερού και του εδάφους.
Ένας άλλος τομέας είναι η ανακάλυψη νέων γονιδίων ασθένειας, ειδικά για πολυγονικές διαταραχές. Το NGS συνέβαλε στη σημαντική αύξηση των σπάνιων γενετικών διαταραχών που αναφέρονται στη βάση δεδομένων Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) (https://omim.org/), με περισσότερα από 15000 γονίδια.
Ένας σημαντικός αντίκτυπος του NGS στην ιατρική πρακτική είναι η βελτίωση των διαγνωστικών / προγνωστικών για καρκίνο, μη επεμβατική προγεννητική εξέταση για γενετικές / κληρονομικές διαταραχές και μολυσματικές ασθένειες.
Στην ιατρική ακριβείας, η NGS έχει επιτρέψει την προσαρμογή θεραπειών με βάση τη γονιδιωματική και την εθνοτική ποικιλομορφία. Για παράδειγμα, η δόση του αραιωτικού αίματος, η βαρφαρίνη, προσαρμόζεται συνήθως με βάση συγκεκριμένους γονότυπους που επιβεβαιώνονται από μελέτες συσχέτισης σε ολόκληρο το γονιδίωμα και έχει βελτιώσει σημαντικά τα αποτελέσματα των ασθενών. Η ανάπτυξη εξατομικευμένων καρκινικών φαρμάκων, όπως ο αναστολέας BRAF (V600E) κινάσης, RO5185426, είναι αποτελεσματικός μόνο κατά των όγκων με τη μετάλλαξη BRAF (V600E) και την έγκριση του πρώτου εξατομικευμένου φαρμάκου, erlotinib, με βάση μεταλλάξεις στον υποδοχέα EGF, παραδείγματα προγνωστικών που βασίζονται στο NGS. Το πεδίο των συνοδευτικών διαγνωστικών, όπου ένα διαγνωστικό τεστ χρησιμοποιείται ως σύντροφος ενός φαρμάκου για να προσδιοριστεί η εφαρμογή του σε ένα συγκεκριμένο άτομο, είναι ένας άλλος τομέας ιατρικής πρακτικής που επηρεάζεται από το NGS.
Στην κλινική μικροβιολογία, εάν οι μολυσματικές ασθένειες προκαλούνται από βακτήρια, μύκητες ή ιούς, είναι συχνά ευκολότερο να εντοπιστεί η παρουσία ενός νέου παθογόνου και πρώιμων σημείων ή επιπτώσεων λοίμωξης από το NGS, παρά να περιμένουμε τα συμπτώματα να εκδηλωθούν ή να αντιμετωπίσουν καταστάσεις όπου τα συμπτώματα δεν δείχνουν εύκολα ένα δεδομένο παθογόνο. Ένα τέλειο παράδειγμα αυτού είναι η τρέχουσα κατάσταση COVID19 με πολλούς ασυμπτωματικούς φορείς που μπορεί να έχουν τον ιό να εντοπιστούν από το NGS, ακόμη και αν δεν εμφανίζουν συμπτώματα. Οι διαγνωστικές πρακτικές που βασίζονται στην καλλιέργεια του παθογόνου μπορεί να διαρκέσουν ημέρες και είναι πιθανό να αντικατασταθούν από το NGS.
Το ανθρώπινο σώμα φιλοξενεί πολλά συμβιωτικά, παθογόνα ή κοινά μικρόβια που παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανθρώπινη υγεία και ευεξία. Το μεταγονιδιωματικό NGS του 16S ριβοσωμικού RNA είναι το εργαλείο που χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό των μικροβιακών πληθυσμών και των διαταραχών τους στο ανθρώπινο μικροβίωμα σε φυσιολογικούς ή νοσούντες ανθρώπους. Καθώς αυτό το πεδίο προχωρά και κατανοούμε τις συνέπειες των διαταραχών των μικροβίων σε ασθένειες, χρησιμοποιούνται θεραπευτικές παρεμβάσεις για τη θεραπεία ορισμένων ασθενειών με χειρισμούς της σύνθεσης του μικροβίου.
Το NGS μεταμορφώνει επίσης το πρόσωπο της γεωργίας και καθιστά δυνατή την αναγνώριση, παρακολούθηση και διάδοση επιθυμητών χαρακτηριστικών και αποφάσεων αναπαραγωγής σε φυτά και ζώα. Με το 40% της παγκόσμιας παραγωγής τροφίμων να χάνεται από ασθένειες και παράσιτα, η NGS βοηθά στην παρακολούθηση της πηγής των φυτικών ασθενειών και προτείνει τρόπους εξάλειψης τέτοιων ασθενειών ή παρασίτων. Αυτό έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει την παραγωγικότητα της γεωργίας σε μια εποχή που η χρήση γης μειώνεται, ο παγκόσμιος πληθυσμός αυξάνεται και ο αντίκτυπος της κλιματικής αλλαγής αυξάνει τις βιοτικές και αβιοτικές πιέσεις που αντιμετωπίζουν οι καλλιέργειες. Το WGS πολλών μεγάλων παγκόσμιων καλλιεργειών έχει ολοκληρωθεί την τελευταία δεκαετία, καθώς και αυτό για μερικές καλλιέργειες που έχουν ιδιαίτερη σημασία για τον αναπτυσσόμενο κόσμο, όπως μανιόκα, γιαμ, tef, περιστέρι μπιζέλι, φυστίκι και αμάραντο.
Τέλος, το NGS έχει μεγάλο αντίκτυπο στη γεωργία καθώς επιτρέπει νέες τεχνολογίες επεξεργασίας γονιδίων, επεξεργασίας βάσης και πρώτης επεξεργασίας, οι οποίες έχουν τη δυνατότητα να φέρουν επανάσταση στην παραδοσιακή αναπαραγωγή φυτών για τη βελτίωση των ποικιλιών φυτών και καλλιεργειών.
Συγγραφείς: Dr. Subha Srinivasan, Tata Institute for Genetics and Society & Institute of Bioinformatics and Applied Biotechnology and Dr. Suresh Subramani, Tata Institute for Genetics and Society, India and University Of California, San Diego, USA
Σχετικά με τον Δρ Suresh Subramani
Ο Δρ Suresh Subramani έλαβε το διδακτορικό του από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια (UC), Μπέρκλεϊ, ΗΠΑ. Έγινε μέλος της σχολής στο UC San Diego το 1982, μετά την ολοκλήρωση της μεταδιδακτορικής εργασίας στο εργαστήριο του βραβείου Νόμπελ, Paul Berg, στο Πανεπιστήμιο του Στάνφορντ (1979-81). Είναι ο αποδέκτης πολλών τιμών και βραβείων και έχει συμμετάσχει σε πολλούς ηγετικούς ρόλους στον ακαδημαϊκό χώρο και στη βιομηχανία βιοτεχνολογίας. Σήμερα είναι Διακεκριμένος Καθηγητής (Ομότιμος), Παγκόσμιος Διευθυντής του Ινστιτούτου Tata για τη Γενετική και την Κοινωνία (TIGS, στο UC San Diego, ΗΠΑ και στο Ινστιτούτο Βιολογίας Βλαστικών Κυττάρων και Αναγεννητικής Ιατρικής (inStem), Bangalore, Ινδία) και κατέχει την Προικισμένη Καθηγήτρια του Tata στη Μοριακή Βιολογία στο UC San Diego.
Σχετικά με τον Δρ. Subha Srinivasan
Ο Δρ Subha Srinivasan ηγείται των ερευνητικών προσπαθειών της TIGS για τη βιοπληροφορική στο Ινστιτούτο Βιοπληροφορικής και Εφαρμοσμένης Βιοτεχνολογίας (IBAB). Ολοκλήρωσε το διδακτορικό της από το Κέντρο Προηγμένης Μελέτης στη Βιοφυσική, στο Πανεπιστήμιο του Madras και μετά τη διδακτορική έρευνα από το Roswell Park Memorial Institute, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ. Ίδρυσε και υπηρέτησε ως Διευθύντρια Επιστημονικής Υπηρεσίας της Jivan Biologics, η οποία ειδικεύεται στις υπηρεσίες μικροσυστοιχιών για εναλλακτική σύνδεση. Η ομάδα της στο IBAB εφαρμόζει τεχνικές γονιδιωματικής και βιοπληροφορικής στην ανακάλυψη βιοδείκτη καρκίνου, στη γονιδιωματική των φυτών και των εντόμων, στα μεταγονιδιωματικά των ριζών, στη διατροφική γονιδιωματική και στα μη επεμβατικά διαγνωστικά.
Σχετικά με το Tata Institute for Genetics and Society
Το Ινστιτούτο Tata για τη Γενετική και την Κοινωνία (TIGS) είναι ένα ίδρυμα που έχει δεσμευτεί να κάνει επιστημονικές προόδους στην έρευνα για την ανθρώπινη υγεία και τη γεωργία, ιδίως προς όφελος της Ινδίας και του Ινδικού πληθυσμού. Το ινστιτούτο εργάζεται σε τομείς που απαιτούν άμεσες και συνεργιστικές προσπάθειες που σχετίζονται με την Ινδία. Αυτή είναι μια ακόμη βασική επένδυση που πραγματοποιήθηκε από την Tata Trusts, την παλαιότερη, μη σεχταριστική, φιλανθρωπική οργάνωση της Ινδίας, η οποία για πάνω από 125 χρόνια πρωτοστάτησε σε τέτοιες επενδύσεις σε εκπαίδευση, υποδομές, υγειονομική περίθαλψη, πληροφορική και άλλες τεχνολογίες με σκοπό να ωφελήσει την ινδική κοινωνία. Σύμφωνα με το φιλανθρωπικό όραμα της Tata Trusts, ερευνητικές ομάδες στο TIGS εργάζονται για την εφαρμογή νέων εργαλείων και τεχνικών στη γενετική μηχανική για τη βελτίωση της ασφάλειας της υγείας και της ασφάλειας των τροφίμων στην Ινδία.
