Ηθική δήλωση

Πραγματοποιήθηκαν μελέτες σε ζώα σύμφωνα με τις συστάσεις του Οδηγού για τη φροντίδα και τη χρήση των εργαστηριακών ζώων των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Τα πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων στην Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου της Ουάσιγκτον (αριθμός διασφάλισης A3381-01).

Στατιστικές και αναπαραγωγιμότητα

Δεν χρησιμοποιήθηκε καμία στατιστική μέθοδος για τον προκαθορισμό του μεγέθους του δείγματος. Προηγούμενη εμπειρία με τις τεχνικές μέτρησης και τις δυναμικές περιοχές τους χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των μεγεθών του δείγματος. Πειράματα μεγάλης κλίμακας (π.χ. Εικ. 2 και 4) δεν επαναλήφθηκαν σε ένα ξεχωριστό πείραμα στο σύνολό τους, αλλά οι κορυφαίες συνθήκες επαναλήφθηκαν ανεξάρτητα σε ξεχωριστά πειράματα με ταιριαστά αποτελέσματα. Άλλα πειράματα γενικά επαναλήφθηκαν σε ένα ξεχωριστό πείραμα τουλάχιστον μία φορά, με τα αποτελέσματα να ταιριάζουν με τα δεδομένα που αναφέρονται σε αυτήν την εργασία. Τα πειράματα δεν τυχαιοποιήθηκαν επειδή δεν πραγματοποιήθηκαν μελέτες σε ζώα ή κλινικές δοκιμές για την αξιολόγηση μιας ιατρικής παρέμβασης. Οι ερευνητές δεν τυφλώθηκαν στην κατανομή κατά τη διάρκεια των πειραμάτων και της αξιολόγησης των αποτελεσμάτων, επειδή δεν πραγματοποιήθηκαν μελέτες σε ζώα ή κλινικές δοκιμές. Ένα αντίγραφο ενός δείγματος ελέγχου στα δεδομένα που σχετίζονται με το Σχ. 4 εξαιρέθηκε από την ανάλυση λόγω σφάλματος χειρισμού υγρών. Το αντίγραφο περιλαμβάνεται στα δεδομένα προέλευσης και σχολιάζεται ως εξαιρείται.

Τα δείγματα θεωρούνταν διαφορετικά από το υπόβαθρο εάν εμφανίζονταν p < 0.05 σε ένα τεστ t διπλής όψης και είχε τιμή που ήταν πέρα ​​από το όριο ανίχνευσης (μέση τιμή φόντου ± 3x τυπική απόκλιση της μέτρησης φόντου). Η διαδικασία Benjamini και Hochberg False Discovery Rate⁵⁰ χρησιμοποιήθηκε για τη διόρθωση για πολλαπλές δοκιμές. Έγιναν στατιστικές αναλύσεις σε python. Διεξήχθησαν δοκιμές t δύο όψεων (δύο ουρών, δύο δείγματα, υποθετική ίση διακύμανση) χρησιμοποιώντας το πακέτο scipy και η διαδικασία FDR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο statsmodels με οικογενειακό ποσοστό σφάλματος 5%. Για τον έλεγχο αντισωμάτων, τα ακόλουθα δείγματα χρησιμοποιήθηκαν ως μέτρηση του υποβάθρου και τα συνδυασμένα δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν στο τεστ t. Συναρμολόγηση: Χωρίς DNA και σφαιρίδια μόνο έλεγχοι. Σύνδεση S6P: Χωρίς DNA και σφαιρίδια μόνο μάρτυρες. Δέσμευση RBD: Χωρίς DNA και σφαιρίδια μόνο μάρτυρες. Διαγωνισμός ACE2: Χωρίς DNA και aHER2.

Οι συντελεστές συσχέτισης Pearson υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το GraphPad Prism 9.

λογισμικό

Αλληλουχίες BCR μονοκυττάρου αναλύθηκαν με Cell Ranger v3.1.0. Τα δεδομένα AlphaLISA αναλύθηκαν με Prism 9.5.1. Οι εικόνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας ImageJ2 v2.9.0/1.53t. Τα δεδομένα του προγράμματος ανάγνωσης πλακών υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας Python 3.8.8. Ο κώδικας Python για την ανάλυση των δεδομένων του αναγνώστη πλακών δεν ήταν κεντρικός στην έρευνα και δεν κατατέθηκε.

Σχεδιασμός αλληλουχίας αντισώματος sdFab

Τα sdFab συναρμολογήθηκαν με βάση μια τροποποιημένη έκδοση πρωτοκόλλων που είχαν δημοσιευτεί στο παρελθόν^16,17,18. Παραδείγματα πλασμιδιακών χαρτών των sdFabs βαριάς και ελαφριάς αλυσίδας aHER2 μπορούν να βρεθούν στα δεδομένα Πηγή. Οι αλληλουχίες αντισωμάτων συλλέχθηκαν από τη βιβλιογραφία και οι ελαφριές αλυσίδες τους ταξινομήθηκαν είτε ως κάπα είτε ως λάμδα μέσω του τερματικού υπολείμματος του τμήματος J στην περιοχή VL. Οι περιοχές VH και VL στη συνέχεια συντήχθηκαν με τις αντίστοιχες βαριές αλυσίδες ανθρώπινης σταθεράς (Uniprot P0DOX5) ή ανθρώπινη σταθερή ελαφριά (kappa CL Uniprot P01834 ή λάμδα 1 CL Uniprot P0CG04). Στο Ν-άκρο των περιοχών VH και VL, επιλέξαμε να συμπεριλάβουμε μια τροποποιημένη ετικέτα έκφρασης με βάση τα πρώτα 5 υπολείμματα του Ε. coli Γονίδιο ακετυλοτρανσφεράσης χλωραμφενικόλης ακολουθούμενο από θέση διάσπασης πρωτεάσης από τον ιό του καπνού (TEV) (αλληλουχία πρωτεΐνης: MEKKIENLYFQS, αλληλουχία DNA: atggagaaaaaaatcgaaaacctgtacttccagagc)⁷⁹ σε αντίθεση με την προηγουμένως δημοσιευμένη ετικέτα SKIK⁸⁰. Η βαριά αλυσίδα συντήχθηκε με την υπομονάδα ετεροδιμερούς LZA (AQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQK) και μια ετικέτα strep II ή ετικέτα super FLAG (sFLAG)⁸¹. Η ελαφριά αλυσίδα συντήχθηκε με την υπομονάδα ετεροδιμερούς LZB (AQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKKLAQK). Αντισώματα στην οθόνη στο Σχ. 2 σχεδιάστηκαν με την ετικέτα strep II στη βαριά αλυσίδα τους. Αλληλουχίες αντισωμάτων από τις οθόνες στα Σχ. 3 και 4 σχεδιάστηκαν με την ετικέτα sFLAG στη βαριά αλυσίδα τους. Αντισώματα στην οθόνη στο Σχ. 2 και τα αντισώματα EUA στο Σχ. 3 σχεδιάστηκαν με την φυσική τους κατηγορία ελαφριάς αλυσίδας (κάπα ή λάμδα). Αντισώματα στην οθόνη στο Σχ. 4 και οι ευρέως εξουδετερωτικές αλληλουχίες αντισωμάτων σχεδιάστηκαν με ελαφριά αλυσίδα κάπα, ανεξάρτητα από την κατηγορία φυσικής ελαφριάς αλυσίδας. Παραδείγματα των τριών τύπων αλληλουχιών αντισωμάτων περιγράφονται λεπτομερώς παρακάτω, με τα σημαντικά χαρακτηριστικά της αλληλουχίας να επισημαίνονται σε αγκύλες [ ].

sdFab σταθερά βαριάς αλυσίδας strepII με ετικέτα:

[MEKKIENLYFQS][VH_Sequence][ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC]GGLEGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC]GGLEKGAKLEKS SA[WSHPQFEK].

sdFab σταθερά βαριάς αλυσίδας super FLAG (sFLAG) με ετικέτα:

[MEKKIENLYFQS][VH_Sequence][ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC]GGLEGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC]GGLEKGAKLEKS SA[DYKDEDLL].

Κάπα ελαφριάς αλυσίδας sdFab:

[MEKKIENLYFQS][VL_Sequence][RTVAAPSVFIFPPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFGNGKKKLKLKSGTQGLGKKLKLKLKKLKGKLKGKLKLKLKLKLKLKKLKKLKKLKKLKLKLKLKLKLKLKLKLKLKLKLKLKLKSGKLKLKLKLKSGKLKGKLKSQLKLKLKSQLKLKLKSQLKLKKLKSQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFGNKLKKL QALKKKLAQK].

sdFab ελαφριά αλυσίδα λάμδα 1:

[MEKKIENLYFQS][VL_Sequence][GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS]GGGGKKKKKLQALQLGGGKKKKKLQA ].

Συναρμολόγηση DNA και δημιουργία προτύπου γραμμικής έκφρασης (LET).

Οι πρωτεΐνες που θα παραχθούν μέσω CFPS βελτιστοποιήθηκαν με κωδικόνια χρησιμοποιώντας το εργαλείο βελτιστοποίησης κωδικονίων IDT και παραγγέλθηκαν ως δίκλωνο γραμμικό DNA που περιέχει τις επιθυμητές προεξοχές συγκροτήματος Gibson από το IDT ή το GenScript. Παραγγέλθηκε το sfGFP που περιέχει τους δύο προεξοχές του συγκροτήματος pJL1 Gibson. Το DNA αντισώματος VH παραγγέλθηκε με το pJL1 5' και η σταθερά βαριάς αλυσίδας ανθρώπινης IgG1 προεξοχές 5' Gibson. Το DNA αντισώματος VL παραγγέλθηκε με το pJL1 5' και το συγκρότημα ελαφριάς αλυσίδας ανθρώπινης Ig κάππα ή λάμδα 1 Gibson προεξέχει. Το DNA επαναιωρήθηκε σε συγκέντρωση 50 ng/μL και χρησιμοποιήθηκε χωρίς ενίσχυση.

Πρόσθετα γραμμικά συστατικά DNA για τη συγκρότηση Gibson (ραχοκοκαλιά pJL1, σταθερά sdFab βαριάς αλυσίδας με ετικέτα strepII, σταθερά sdFab ελαφριάς αλυσίδας κάπα, σταθερά sdFab ελαφριάς αλυσίδας λάμδα 1) παραγγέλθηκαν ως gblocks από την IDT. Αυτά τα συστατικά ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας PCR χρησιμοποιώντας Q5 Hot Start DNA πολυμεράση (NEB, M0493L) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το ενισχυμένο DNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ DNA Clean and Concentrate (Zymo Research, D4006) και αραιώθηκε σε συγκέντρωση 50 ng/μL. Οι αλληλουχίες των χρησιμοποιούμενων συστατικών παρατίθενται παρακάτω, με τις αλληλουχίες συγκροτήματος Gibson να υποδεικνύονται με υπογραμμισμένο πεζό κείμενο και τους εκκινητές για ένα δεδομένο αμπλικόνιο να παρατίθενται κάτω από την αλληλουχία DNA.

Προεξοχές συγκροτήματος Gibson:

pJL1 5′ Γκίμπσον: tttgtttaactttaagaaggagatatacat.

pJL1 3′ Γκίμπσον: gtcgaccggctgctaacaaagcccgaaagg.

Ανθρώπινη σταθερά βαριάς αλυσίδας IgG1 5′ Gibson: gcgtcaacaaaaggtccttcagttttcccattagcccct.

Ανθρώπινη ελαφριά αλυσίδα Ig κάπα 5′ Γκίμπσον: cgcacggtcgcggcgccgtctgtttttttttttcctcct.

Ανθρώπινη ελαφριά αλυσίδα Ig λάμδα 5′ Gibson: ggccaacccaaagcaaacccaactgtcactttgttcccg.

Γραμμική ραχοκοκαλιά πλασμιδίου pJL1 (Addgene πλασμίδιο # 69496):

gtcgaccggctgctaacaaagcccgaaaggAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCTTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATtttgtttaactttaagaaggagatatacat.

pJL1_F: gtcgaccggctgcta.

pJL1_R: atgtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctta.

Γραμμική σταθερά βαριάς αλυσίδας sdFab strepII με ετικέτα:

gcgtcaacaaaaggtccttcagttttcccattagcccctTCTTCTAAGTCAACTAGTGGCGGTACTGCCGCTCTTGGGTGTTTGTTAAAGATTACTTCCCAGAACCGGTTACGGTCTCGTGGAACTCTGGTGCACTGACATCGGGCGTACATACATTTCCCGCAGCAGTTTTGCAGTCTTCGTTAAAGATTACTTCCCAGAACCGGTTACGGTCTCGTGGAACTCTGGTGCACTGACATCGGGCGTACATACATTTCCCGCAGCAGTTTTGCAGTCTTCGTAAAGATTACTTCCCAGAACCGGTTACGGTCTCGTGGAACTCTGGTGCACTGACATCGGGCGTACATACATTTCCCGCAGCAGTTTTGCAGTCTTCGGGATTGTCGTA CACAGACCTACATTTGTAATGTTAATCATAAGCCGAGTAATACTAAGGTGGATAAAAAGGTGGAACCGAAGTCTTGTGGTGGTGGGCGGGTCAGCTCAACTGGAGAAGGAGTTACAGGCACTGGAAAAAGAGAATGCTCAACTTGAGTGAGAGAGAACCGAATGATGAT GGTCACATCCCCAGTTCGAAAAATAAgtcgaccggctgctaacaaagcccgaaagg.

Γραμμική σταθερά βαριάς αλυσίδας sdFab super FLAG με ετικέτα:

gcgtcaacaaaaggtccttcagttttcccattagcccctTCTTCTAAGTCAACTAGTGGCGGTACTGCCGCTCTTGGGTGTTTGTTAAAGATTACTTCCCAGAACCGGTTACGGTCTCGTGGAACTCTGGTGCACTGACATCGGGCGTACATACATTTCCCGCAGCAGTTTTGCAGTCTTCGTTAAAGATTACTTCCCAGAACCGGTTACGGTCTCGTGGAACTCTGGTGCACTGACATCGGGCGTACATACATTTCCCGCAGCAGTTTTGCAGTCTTCGTAAAGATTACTTCCCAGAACCGGTTACGGTCTCGTGGAACTCTGGTGCACTGACATCGGGCGTACATACATTTCCCGCAGCAGTTTTGCAGTCTTCGGGATTGTCGTA CACAGACCTACATTTGTAATGTTAATCATAAGCCGAGTAATACTAAGGTGGATAAAAAGGTGGAACCGAAGTCTTGTGGTGGTGGGCGGGTCAGCTCAACTGGAGAAGGAGTTACAGGCACTGGAAAAAGAGAATGCTCAACTTGAGTGAGAGAGAACCGAAGTCTTGTGGTGGTGGGCGGGTCAGCTCAACTGGAGAAGGAGTTACAGGCACTGGAAAAAGAGAATGCTCAACTTGAGTGAGAGAGAACGAGATGAT CAGCAGCTCCTGCGCCTGGCGGGGACTACAAAGATGAAGACCTTCTTTAAgtcgaccggctgctaacaaagcccgaaagg.

IgGC_F: GCGTCAACAAAAGGTCCTTCAGTTTTC.

pJL1_3′Gib_R: CCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGC.

Γραμμική σταθερά κάπα ελαφριάς αλυσίδας sdFab:

cgcacggtcgcggcgccgtctgtttttttttttcctcctTCTGATGAACAGCTTAAATCTGGGACAGCTTCTGTTGTATGTTTATTAAACAACTTTTACCCGCGTGAGGCAAAAGTTCAATGGAAGGTAGACAACGCACTGCAAAGCGGAAATTCGCAGGAGTCAGTTACCGAACAGTATGTTTATTAAACAACTTTTACCCGCGTGAGGCAAAAGTTCAATGGAAGGTAGACAACGCACTGCAAAGCGGAAATTCGCAGGAGTCAGTTACCGAACAGGATTCCAAGGATAGTACCGAACAGGATTCCAAGGATAGTACCTAACCATAAGTA AGGTATATGCCTGCGAAGTAACTCATCAGGGCTTATCATCCCCAGTTACAAAATCTTTCAACCGTGGAGAATGCGGCGGCGGGAGGTAGCGCGCAGCTTAAGAAAAAATTGCAAGCCCTTAAAAAAAAAAATGCCCAACTTAAATGGAAGCTGAGAGAGAATGAgtcgaccggctgctaacaaagcccgaaagg.

kLC_F: TCGCGGCGCCGTCTG.

pJL1_3′Gib_R: CCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGC.

Γραμμική σταθερά ελαφριάς αλυσίδας sdFab λάμδα 1:

ggccaacccaaagcaaacccaactgtcactttgttcccgCCCTCAAGCGAGGAACTTCAGGCTAATAAGGCCACGCTTGTTTGCCTGATCTCAGACTTTTATCCCGGTGCCGTAACAGTGGCTTGGAAGGCAGATGTTCGCCGGTCAAAGCGAGGCGTGAGAAACTACAAAGCCATGATCTCAGACTTTTATCCCGGTGCCGTAACAGTGGCTTGGAAGGCAGATGTTCGCCGGTCAAAGCGGGGCGTGAGAAACTACAAAGCCATCGAAACAGGAACTAGATTACAAC TGGAAGTCACACCGCTCGTACAGTTGTCAAGTTACACACGAGGGGAAGTACAGTTGAAAAGACCGTTGCCCCAACTGAATGTTCAGGCGGTGGTGGCTCAGCGCAGTAAAGAAAAAACTGCAGGCTACACACGAGGGGAAGTACAGTTGAAAAGACCGTTGCCCCAACTGAATGTTCAGGCGGTGGTGGCTCAGCGCAGTAAAGAAAAAACTGCAGGCTATTGAAGAAAAAGAATGCTCAGAAAGACACCGTTGCCCCAACTGAATGTTCAGGCGGTGGTGTGCTCAGCGCAGTAAAGAAAAAACTGCAGGCTTATTGAAGAAAAGAATGCTCAGAATTAGATTAGATAGATgtcgaccggctgctaacaaagcccgaaagg.

lLC_F: GGCCAACCCAAAGCAAACC.

pJL1_3′Gib_R: CCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGC.

Γραμμική sfGFP (ίδια αλληλουχία DNA με το πλασμίδιο Addgene #102634). Σημειώστε ότι η αλληλουχία του sfGFP έχει τροποποιηθεί σε μεγάλο βαθμό και περιέχει μεταλλάξεις από τους Bundy et al.⁸².

tttgtttaactttaagaaggagatatacatATGAGCAAAGGTGAAGAACTGTTTACCGGCGTTGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATGGCGATGTGAACGGTCACAAATTCAGCGTGCGTGGTGAAGGTGAAGGCGATGCCACGATTGGCAAACTGACGCTGAAATTTATCTGCACCACCGGCAAACTGCCGGTGCCGTGGCCGACGCTGGTGACCACCCTGACCTATGGCGTTCAGTGTTTTAGTCGCTATCCGGATCACATGAAACGTCACGATTTCTTTAAATCTGCAATGCCGGAAGGCTATGTGCAGGAACGTACGATTAGCTTTAAAGATGATGGCAAATATAAAACGCGCGCCGTTGTGAAATTTGAAGGCGATACCCTGGTGAACCGCATTGAACTGAAAGGCACGGATTTTAAAGAAGATGGCAATATCCTGGGCCATAAACTGGAATACAACTTTAATAGCCATAATGTTTATATTACGGCGGATAAACAGAAAAATGGCATCAAAGCGAATTTTACCGTTCGCCATAACGTTGAAGATGGCAGTGTGCAGCTGGCAGATCATTATCAGCAGAATACCCCGATTGGTGATGGTCCGGTGCTGCTGCCGGATAATCATTATCTGAGCACGCAGACCGTTCTGTCTAAAGATCCGAACGAAAAAGGCACGCGGGACCACATGGTTCTGCACGAATATGTGAATGCGGCAGGTATTACGTGGAGCCATCCGCAGTTCGAAAAATAAgtcgaccggctgctaacaaagcccgaaagg.

Το συγκρότημα Gibson χρησιμοποιήθηκε για τη συναρμολόγηση του DNA ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης πρωτεΐνης με τη ραχοκοκαλιά pJL1 ακολουθώντας το δημοσιευμένο πρωτόκολλο με την προσθήκη 3.125 μg/mL ET SSB (NEB, αρ. προϊόντος M2401S)^83,84. 20 ng καθαρισμένου, γραμμικού σκελετού pJL1, 20 ng καθαρισμένου, γραμμικού σταθερού DNA sdFab VH ή VL και 20 ng του ενθέτου ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης πρωτεΐνης συνδυάστηκαν σε αντιδράσεις συναρμολόγησης 2 μL Gibson και επωάστηκαν στους 50 °C για 30 λεπτά. Οι μη καθαρισμένες αντιδράσεις συναρμολόγησης αραιώθηκαν σε 40 μL νερού χωρίς νουκλεάση (Fisher Scientific, AM9937) και 1 μL της αραιωμένης αντίδρασης χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για μια PCR για τη δημιουργία προτύπων γραμμικής έκφρασης (LETs) για CFPS. Τα πρότυπα γραμμικής έκφρασης ενισχύθηκαν μέσω PCR χρησιμοποιώντας τους εκκινητές pJL1_LET_F (ctgagatacctacagcgtgagc) και pJL1_LET_R (cgtcactcatggtgatttctcacttg) σε μια αντίδραση PCR 50 μL χρησιμοποιώντας την Q5 Hot Start DNA πολυμεράση (NE0493L) κατασκευαστή (NEXNUMXL)

Η αλληλουχία DNA του P. pyralis Η λουσιφεράση που περιέχει μια c-τερματική ετικέτα strepII (fLuc, Uniprot Q27758) που χρησιμοποιείται ως αρνητικός έλεγχος είναι παρακάτω και κλωνοποιήθηκε στον φορέα pJL1.

.

Παρασκευή εκχυλίσματος κυττάρων για πρωτεϊνική σύνθεση χωρίς κύτταρα

Ε. coli Origami^TM Τα εκχυλίσματα B(DE3) (Novagen, 70837) παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη έκδοση των καθιερωμένων πρωτοκόλλων^85,86. Εν συντομία, ένα Origami 150 mL^TM Η καλλιέργεια εκκίνησης Β(DE3) εμβολιάστηκε σε LB από ένα απόθεμα γλυκερίνης και καλλιεργήθηκε σε μια φιάλη με διάφραγμα 250 mL στους 37 °C για 16 ώρες. Το 2xYTP παρασκευάστηκε χωρίς γλυκόζη στο 75% του τελικού όγκου και αποστειρώθηκε χρησιμοποιώντας αυτόκλειστο. Παρασκευάστηκε ένα διάλυμα γλυκόζης 4x και τοποθετήθηκε σε αυτόκλειστο χωριστά, στη συνέχεια προστέθηκε στο μέσο αμέσως πριν από τη χρήση. Οι καλλιέργειες έναρξης χρησιμοποιήθηκαν για τον εμβολιασμό 1 L μέσου 2xYTPG (16 g/L τρυπτόνη, 10 g/L εκχύλισμα ζύμης, 5 g/L χλωριούχο νάτριο, 7 g/L διβασικό φωσφορικό κάλιο, 3 g/L μονοβασικό φωσφορικό κάλιο, 18 g/L γλυκόζης) σε αναδευόμενη φιάλη 2.5 L Full-Baffle Tunair σε αρχική OD600 0.08. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37°C στις 220 RPM σε έναν επωαστήρα ανακίνησης. Οι καλλιέργειες αναπτύχθηκαν μέχρι OD600 0.4-0.6, στο οποίο σημείο η έκφραση της Τ7 RNA πολυμεράσης προκλήθηκε με την προσθήκη IPTG σε τελική συγκέντρωση 0.5 mM. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε OD600 2.5 μέσω φυγοκέντρησης στα 12,000 × g για 1 λεπτό στους 4 °C. Τα κυτταρικά σφαιρίδια πλύθηκαν τρεις φορές με 25 mL ρυθμιστικού διαλύματος S30 ανά 50 mL καλλιέργειας (10 mM οξικό Tris ρΗ 8.2, 14 mM οξικό μαγνήσιο και 60 mM οξικό κάλιο). Τα σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος S30 ανά γραμμάριο κυτταρικής μάζας. Τα κυτταρικά εναιωρήματα λύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μόνο πέρασμα σε ομογενοποιητή Avestin EmulsiFlex-B15 σε πίεση λύσης 24,000 PSI. Τα κυτταρικά υπολείμματα διαχωρίστηκαν μέσω φυγοκέντρησης στα 18,000 χ g για 20 λεπτά, και το διαυγασμένο προϊόν λύσης συλλέχθηκε, καταψύχθηκε αμέσως σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκε στους -80 °C.

Αντιδράσεις πρωτεϊνοσύνθεσης χωρίς κύτταρα

Οι αντιδράσεις CFPS αποτελούνταν από τα ακόλουθα αντιδραστήρια: 8 mM γλουταμικό μαγνήσιο, 10 mM γλουταμικό αμμώνιο, 130 mM γλουταμικό κάλιο, 1.2 mM ATP, 0.5 mM από κάθε CTP, GTP και UTP. 0.03 mg/mL φυλλινικού οξέος, 0.17 mg/mL Ε. coli MRE600 tRNA (Roche 10109541001), 100 mM NAD, 50 mM CoA, 4 mM οξαλικό οξύ, 1 mM πουτρεσκίνη, 1 mM σπερμιδίνη, 57 mM HEPES ρΗ 7.2, 2 mM από κάθε αμινοξύ v33.3, mV% EP20, Ε. coli εκχύλισμα, ποικίλες συγκεντρώσεις μήτρας DNA και το υπόλοιπο νερό. Η παρασκευή αυτών των αντιδραστηρίων έχει περιγραφεί λεπτομερώς αλλού⁸⁷. Για εκμαγεία DNA, χρησιμοποιήθηκαν πλασμίδια σε συγκέντρωση 8 ηΜ και μη καθαρισμένα γραμμικά προϊόντα PCR χρησιμοποιήθηκαν στο 6.66% (ο/ο). Για την έκφραση των αντισωμάτων, κάθε εκμαγείο προστέθηκε σε τελική συγκέντρωση 6.66% (ν/ν). Για την έκφραση αντισωμάτων και sdFab 4 mM οξειδωμένης γλουταθειόνης, 1 mM ανηγμένης γλουταθειόνης, 14 μΜ καθαρισμένου DsbC και 50 μΜ FkpA συμπληρώθηκαν επίσης στις αντιδράσεις. Επιπλέον, για τις οξειδωτικές αντιδράσεις CFPS, τα κυτταρικά εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 500 μM ιωδοακεταμίδιο (ΙΑΜ) σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά πριν από τη χρήση σε CFPS⁸⁸. Όλα τα συστατικά της αντίδρασης συναρμολογήθηκαν σε πάγο και εκτελέστηκαν είτε ως αντιδράσεις 12 μL σε μικροσωλήνες 1.5 mL είτε ως αντιδράσεις 2 μL σε πλάκες 384 φρεατίων (BioRad, HSP3801). Για αντιδράσεις 2 μL, τα συστατικά μεταφέρθηκαν στην πλάκα χρησιμοποιώντας ακουστικό χειριστή υγρού Echo 525. Ένα μείγμα που περιείχε όλα τα συστατικά CFPS εκτός από το DNA διανεμήθηκε από πλάκες 384PP Plus (Labcyte, PPL-0200) χρησιμοποιώντας τη ρύθμιση BP. Το DNA (μη καθαρισμένα προϊόντα PCR) διανεμήθηκε από μια πλάκα 384LDV Plus (Labcyte, LPL-0200) χρησιμοποιώντας τη ρύθμιση GP. Οι αντιδράσεις αφέθηκαν να προχωρήσουν στους 30°C για 20 ώρες.

Ποσοτικοποίηση αντιδράσεων πρωτεϊνοσύνθεσης χωρίς κύτταρα

Για τον ποσοτικό προσδιορισμό του φθορισμού sfGFP, ετοιμάστηκε μια τυπική καμπύλη χρησιμοποιώντας μεθόδους που αναφέρθηκαν προηγουμένως⁸⁶. Ραδιενεργή λευκίνη προστέθηκε στο CFPS σε τελική συγκέντρωση 10 μΜ L-[14C(U)]-λευκίνης (Perkin Elmer NEC279E250UC, 11.1 GBq/mMole), ακολουθούμενη από καθίζηση των εκφραζόμενων πρωτεϊνών και μέτρηση σπινθηρισμού⁸⁹. Για να ποσοτικοποιηθεί ο φθορισμός sfGFP, 2 μL αντίδρασης CFPS αραιώθηκαν σε 48 μL νερού σε πλάκα μισής επιφάνειας Black Costar 96 πηγαδιών. Ο φθορισμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας BioTek Synergy^TM Αναγνώστης πλακών H1 με μήκη κύματος διέγερσης και εκπομπής 485 και 528, αντίστοιχα. Οι μετρήσεις σπινθηρισμού και ο φθορισμός ήταν κατάλληλοι για τον προσδιορισμό μιας τυπικής καμπύλης για χρήση με μη ραδιενεργά δείγματα.

Για να οπτικοποιηθεί η συναρμολόγηση αντισωμάτων, οι πρωτεΐνες επισημάνθηκαν κατά τη διάρκεια του CFPS με FluoroTect^TM (Promega, L5001). FluoroTect^TM συμπεριλήφθηκε στην αντίδραση CFPS σε 3.33% ν/ν. Μετά την πρωτεϊνική σύνθεση, προστέθηκε RNAseA (Omega Bio-Tek, AC118) σε 0.1 mg/mL και το δείγμα επωάστηκε στους 37 °C για 10 λεπτά. 3 μL του μίγματος CFPS και RNAseA συνδυάστηκαν με 4x ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης (LiCor, 928-40004) και τα δείγματα στη συνέχεια μετουσιώθηκαν στους 70 °C για 3 λεπτά, στη συνέχεια διαχωρίστηκαν μέσω SDS-PAGE και απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα LI-COR Odyssey Fc συσκευή απεικόνισης στο κανάλι 600. Η πυκνομετρία πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

Έκφραση και καθαρισμός DsbC και FkpA

Η έκφραση πρωτεΐνης, ο καθαρισμός και η αφαίρεση της ετικέτας του πραγματοποιήθηκαν παρόμοια με αυτά που αναφέρθηκαν προηγουμένως⁷⁷. Το DsbC (Uniprot P0AEG6, υπολείμματα 21-236) και το FkpA (Uniprot P45523, υπολείμματα 26-270) παραγγέλθηκαν ως gBlock από το IDT που περιείχαν ένα c-τερματικό, TEV με δυνατότητα κοπής της ετικέτας του (GSENLYFQSHHLSHHHH σε p. Οι πλασμιδικοί χάρτες τόσο του DsbC όσο και του FkpA είναι διαθέσιμοι στα δεδομένα προέλευσης. Τα πλασμίδια μετασχηματίστηκαν σε BL28 Star^TM DE3, επιστρώθηκε σε άγαρ LB και καλλιεργήθηκε όλη τη νύχτα στους 37°C. 1 λίτρο Overnight Express TB (Fisher Scientific, 71491-4) εμβολιάστηκε με απόξεση όλων των αποικιών σε μια πλάκα μετασχηματισμού και καλλιεργήθηκε στους 37 °C σε φιάλες τόνου των 2.5 L (IBI Scientific, SS-8003) στις 220 rpm όλη τη νύχτα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε αναλογία 1 g κυτταρικής μάζας προς 4 mL ρυθμιστικού διαλύματος επαναιώρησης (50 mM HEPES ρΗ 7.5, 500 mM NaCl, 1Χ αναστολέας πρωτεάσης HALT χωρίς EDTA (Fisher Scientific, 78429), 1 mg/mL, 62.5 mg/mL1014. /mL κυτταρικό εναιώρημα βενζονάσης (Sigma-Aldrich, E25-15KU)) και λύθηκε χρησιμοποιώντας ομογενοποιητή Avestin B24,000 στα 14,000 PSI. Το προϊόν λύσης περιδινήθηκε XNUMX × g για 10 λεπτά και το διαυγασμένο υπερκείμενο επωάστηκε με Ni-NTA Agarose (Qiagen, 30230) για 60 λεπτά σε έναν αναδευτήρα από άκρη σε άκρη. Η ρητίνη περιδινήθηκε 2500l x g για 2 λεπτά, το υπερκείμενο αφαιρέθηκε, επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (50 mM HEPES ρΗ 7.5, 500 mM NaCl, 50 mM Ιμιδαζόλη), φορτώθηκε σε στήλη βαρυτικής ροής και στη συνέχεια πλύθηκε με 20Χ όγκους ρητίνης ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης. Η πρωτεΐνη εκλούστηκε χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό έκλουσης (50 mM HEPES ρΗ 7.5, 500 mM NaCl, 500 mM Ιμιδαζόλη) και ανταλλάχτηκε σε 50 mM HEPES ρΗ 7.4, 150 mM NaCl χρησιμοποιώντας στήλες αφαλάτωσης PD-10 (Cytvia, σύμφωνα με 17) οδηγίες κατασκευαστή.

Οι ετικέτες του αφαιρέθηκαν μέσω διάσπασης από το ProTEV Plus (Promega, V6102). Πριν από τη διάσπαση, προστέθηκε 10% ν/ν γλυκερόλη στην πρωτεΐνη. Το ProTEV Plus προστέθηκε σε συγκέντρωση 0.5 U/μg καθαρισμένης πρωτεΐνης και DTT προστέθηκε σε συγκέντρωση 1 mM. Οι αντιδράσεις διάσπασης πραγματοποιήθηκαν στους 30°C για 4 ώρες. Το Free His tag και το ProTEV Plus αφαιρέθηκαν με επώαση με Ni-NTA Agarose για 1 ώρα στους 4 °C και συλλογή του υπερκειμένου. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια συγκεντρώθηκαν σε >1 mg/mL (Millipore, UFC800396). Η αφαίρεση της ετικέτας του επικυρώθηκε μέσω του SDS-PAGE και του κιτ ανίχνευσης ιστιδίνης (χηλικό νικέλιο) AlphaScreen (Perkin Elmer, 6760619C).

Αντιδράσεις AlphaLISA

Οι αντιδράσεις AlphaLISA διεξήχθησαν σε 50 mM HEPES ρΗ 7.4, 150 mM NaCl, 1 mg/mL BSA και 0.00015 ν/ν TritonX-100 (στο εξής αναφέρεται ως ρυθμιστικό διάλυμα Άλφα). Όλα τα εξαρτήματα διανεμήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν χειριστή υγρού Echo 525 από μια μικροπλάκα 384-Well Polypropylene 2.0 Plus (Labcyte, PPL-0200) χρησιμοποιώντας τον τύπο υγρού 384PP_Plus_GPSA. Όλα τα συστατικά των αντιδράσεων AlphaLISA παρασκευάστηκαν ως αποθέματα 4x και προστέθηκαν ως 0.5 μL στην τελική αντίδραση των 2 μL για να επιτευχθεί η επιθυμητή συγκέντρωση. Όλες οι αντιδράσεις AlphaLISA πραγματοποιήθηκαν με αντιδράσεις CFPS αραιωμένες σε τελική συγκέντρωση 0.025 ν/ν. Τα σφαιρίδια AlphaLISA συνδυάστηκαν για να παρασκευαστεί ένα απόθεμα 4Χ σε ρυθμιστικό Άλφα αμέσως πριν από τη χρήση και προστέθηκαν στις πρωτεΐνες για να δώσουν συγκέντρωση 0.08 mg/mL σφαιριδίων δότη και 0.02 mg/mL σφαιριδίων δέκτη στην τελική αντίδραση. Όλες οι αντιδράσεις επωάστηκαν με σφαιρίδια AlphaLISA για τουλάχιστον 1 ώρα πριν από τη μέτρηση. Οι μετρήσεις AlphaLISA λήφθηκαν σε συσκευή ανάγνωσης πλακών Tecan Infinite M1000 Pro χρησιμοποιώντας το φίλτρο AlphaLISA με χρόνο διέγερσης 100 ms, χρόνο ολοκλήρωσης 300 ms και χρόνο καθίζησης 20 ms. Πριν από τη μέτρηση, οι πλάκες αφέθηκαν να εξισορροπηθούν μέσα στο όργανο για 10 λεπτά. Για μετρήσεις που αφορούν sdFabs, τα σφαιρίδια πρωτεΐνης Α AlphaLISA αποφεύχθηκαν λόγω της ικανότητας της πρωτεΐνης Α να δεσμεύει ανθρώπινη υποομάδα VH3 Fabs⁹⁰.

Ο αντίκτυπος των αντιδραστηρίων CFPS στο AlphaLISA προσδιορίστηκε με σειριακή αραίωση των καθορισμένων αντιδραστηρίων σε ρυθμιστικό διάλυμα Άλφα και συνδυασμό τους με τις καθορισμένες συνθήκες AlphaLISA. Το κιτ TrueHits (Perkin Elmer, AL900) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της επίδρασης των αντιδραστηρίων CFPS στη χημεία ανίχνευσης Alpha. Τα αντιδραστήρια CFPS αναμίχθηκαν με τα σφαιρίδια δότη και δέκτη και επωάστηκαν για 2 ώρες πριν από τη μέτρηση. Το σημασμένο RBD του (Sino Biological, 40592-V08H) και το ανθρώπινο ACE2 με ετικέτα ανθρώπινου FC (GenScript, Z03484) χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της επίδρασης των αντιδραστηρίων CFPS στις χημικές χημικές ουσίες σύλληψης. Το RBD και το ACE2 αραιώθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Άλφα, αναμίχθηκαν σε τελική συγκέντρωση αντίδρασης 10 ηΜ το καθένα, συνδυάστηκαν με τα αντιδραστήρια CFPS και αφέθηκαν να επωαστούν για 1 ώρα. Ακολούθως προστέθηκαν σφαιρίδια δότη και δέκτη και αφέθηκαν να επωαστούν για μία ακόμη ώρα πριν από τη μέτρηση. Για την ανίχνευση χρησιμοποιήθηκαν σφαιρίδια δότη πρωτεΐνης Α άλφα (Perkin Elmer, AS102), σφαιρίδια δέκτη Ni-Chelate AlphaLISA (Perkin Elmer, AL108) και σφαιρίδια δέκτη AlphaLISA αντι-6xhis (Perkin Elmer, AL178).

Το εμπορικό πείραμα ανταγωνισμού αντισώματος εξουδετέρωσης ACE2 πραγματοποιήθηκε με τα ακόλουθα αντισώματα: nAb1 (Acro Biosystems, SAD-S35), nAb2 (Sino Biological, 40592-MM57), nAb3 (Sino Biological, 40591-MM43), nAb4 (Sino Biological, -R40592). ELISA IC₅₀ Οι τιμές καταγράφηκαν από τη σελίδα του προϊόντος τη στιγμή της αγοράς και μετατράπηκαν σε μg/mL υποθέτοντας MW 150,000 Da εάν αναφέρθηκαν σε M. Τα αντισώματα αραιώθηκαν σειριακά σε ρυθμιστικό διάλυμα Άλφα και αναμίχθηκαν με SARS-CoV-2 RBD (Sino Biological, 40592 -V02H) σε συγκέντρωση 10 ηΜ στην τελική αντίδραση και επωάστηκε για 1 ώρα. Προστέθηκε στη συνέχεια ανθρώπινο ACE2 επισημασμένο με FC ποντικού (Sino Biological, 10108-H05H) και επωάστηκε για 1 ώρα, ακολουθούμενο από ταυτόχρονη προσθήκη των σφαιριδίων δέκτη και δότη. Η ανίχνευση AlphaLISA διεξήχθη με τη χρήση σφαιριδίων Alpha Donor Anti-Mouse IgG (PerkinElmer, AS104) και σφαιριδίων Strep-Tactin AlphaLISA Acceptor (PerkinElmer, AL136). IC₅₀ Οι τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το Prism 9 προσαρμόζοντας τα κανονικοποιημένα δεδομένα στο [Αναστολέας] έναντι της απόκρισης–Η μεταβλητή κλίση (τέσσερις παράμετροι) ταιριάζει με το μέγιστο περιορισμένο σε τιμή 1.

Για όλα τα πειράματα διαλογής αντισωμάτων, τα διαφορετικά αντιδραστήρια και οι συνθήκες AlphaLISA που χρησιμοποιούνται περιγράφονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 2. Οι διαφορετικές μετρήσεις AlphaLISA πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται παρακάτω.

Οι αντιδράσεις συναρμολόγησης AlphaLISA αποτελούνταν από sdFab που εκφράζει το CFPS και είτε αντίσωμα ελαφριάς αλυσίδας κάππα Rabbit Anti-Human (Abcam, ab125919) είτε ελαφριά αλυσίδα Rabbit Anti-Human λάμδα (Abcam, ab124719). Η αντίδραση CFPS που περιείχε το εκφρασμένο sdFab ενδιαφέροντος αναμίχθηκε με το κατάλληλο αντίσωμα κατά της ελαφριάς αλυσίδας και αφέθηκε να εξισορροπηθεί για δύο ώρες πριν από την ταυτόχρονη προσθήκη των σφαιριδίων δέκτη και δότη.

Δέσμευση SARS-CoV-2 S6P Οι αντιδράσεις AlphaLISA αποτελούνταν από sdFab που εκφράζει CFPS και SARS-CoV-2 S6P αντίδραση CFPS που περιείχε το εκφρασμένο sdFab ενδιαφέροντος αναμίχθηκε με το S6P και αφέθηκε να εξισορροπηθεί για δύο ώρες πριν από την ταυτόχρονη προσθήκη του δέκτη και του δότη περιδέραιο.

Οι αντιδράσεις AlphaLISA δέσμευσης RBD SARS-CoV-2 αποτελούνταν από sdFab που εκφράζει CFPS και SARS-CoV-2 RBD. Η αντίδραση CFPS που περιείχε το εκφρασμένο sdFab ενδιαφέροντος αναμίχθηκε με το RBD και αφέθηκε να εξισορροπηθεί για δύο ώρες πριν από την ταυτόχρονη προσθήκη των σφαιριδίων δέκτη και δότη.

Οι αντιδράσεις AlphaLISA ανταγωνισμού ACE2 και RBD αποτελούνταν από sdFab που εκφράζει CFPS, ανθρώπινο ACE2 και SARS-CoV-2 S6P. Η αντίδραση CFPS που περιείχε το εκφρασμένο sdFab ενδιαφέροντος αρχικά αναμίχθηκε με S6P και αφέθηκε να επωαστεί για 1 ώρα. Στη συνέχεια, προστέθηκε ACE2 και αφέθηκε να εξισορροπηθεί για άλλη 1 ώρα πριν από την ταυτόχρονη προσθήκη των σφαιριδίων δέκτη και δότη.

Για την παραλλαγή SARS-CoV-2 και άλλα πειράματα δέσμευσης του κορωνοϊού εκτός SARS-CoV-2, οι μετρήσεις AlphaLISA πραγματοποιήθηκαν με τον ίδιο τρόπο που περιγράφεται για το SARS-CoV-2 S6P. Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες πρωτεΐνες με επισήμανση Hisx6. SARS-CoV-2 S6P (Acro Biosystems, SPN-C52H9), SARS-CoV-2 S6P Alpha/ B.1.1.7 (Δώρο από τη Lauren Carter στο Institute for Protein Design στο Πανεπιστήμιο της Ουάσιγκτον, που εκφράζεται και καθαρίζεται όπως περιγράφεται αλλού-κάπου αλλού⁷⁷), SARS-CoV-2 S6P Beta/B.1.351 (Δώρο από τη Lauren Carter στο Ινστιτούτο Σχεδιασμού Πρωτεϊνών στο Πανεπιστήμιο της Ουάσιγκτον, εκφρασμένο και καθαρισμένο όπως περιγράφεται αλλού⁷⁷), SARS-CoV-2 S6P Gamma/P.1 (Δώρο από τη Lauren Carter στο Ινστιτούτο Σχεδιασμού Πρωτεϊνών στο Πανεπιστήμιο της Ουάσιγκτον, εκφρασμένο και καθαρισμένο όπως περιγράφεται αλλού⁷⁷), SARS-CoV-2 S6P Delta/B.1.617.2 (AcroBiosystems, SPN-C52He), SARS-CoV-2 S6P Omicron/BA.1 (AcroBiosystems, SPN-C52Hz), SARS-CoV-2 S6P Omicron/ BA.2 (AcroBiosystems, SPN-C5223), SARS-CoV-2 S6P Omicron/BA.2.12.1 (AcroBiosystems, SPN-C522d), SARS-CoV-2 S6P Omicron/BA.4/5 (AcroBiosystems, SPN- C522e), SARS-CoV S2P (AcroBiosystems, SPN-S52H6), MERS-CoV S2P (AcroBiosystems, SPN-M52H4), HCoV-HKU1 S (AcroBiosystems, SPN-H52H5), HCoV-OCSP43SHH52, , HCoV-NL63 S (AcroBiosystems, SPN-H52H4) και HCoV-229E S (AcroBiosystems, SPN-H52H3).

Στα δοσοεξαρτώμενα πειράματα τιτλοδότησης ανταγωνισμού ACE2, οι αντιδράσεις CFPS επωάστηκαν με SARS-CoV-2 RBD για 1 ώρα και ακολούθησε η προσθήκη της καθορισμένης συγκέντρωσης (διπλάσια αραιωμένη σειριακά από 100 nM) ανθρώπινου ACE2. Και τα τρία συστατικά επωάστηκαν για μια επιπλέον ώρα πριν από την ταυτόχρονη προσθήκη των σφαιριδίων AlphaLISA. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν για 2 ώρες πριν από τη μέτρηση.

Για τα πειράματα γεφύρωσης RBD και ACE2, το SARS-CoV-2 RBD, το ανθρώπινο ACE2 και η καθορισμένη αραίωση του CFPS (διπλάσια αραίωση σειριακά από 0.025 v/v) επωάστηκαν για 1 ώρα πριν από την ταυτόχρονη προσθήκη των σφαιριδίων AlphaLISA. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν για 2 ώρες πριν από τη μέτρηση.

Ανοσοποίηση ποντικιού, χρώση κυττάρων και ταξινόμηση

Τα θηλυκά C57BL/6 (Στρέλεχος: 000664) αγοράστηκαν από το The Jackson Laboratory. Ζώα ηλικίας έξι εβδομάδων ανοσοποιήθηκαν με 10¹⁰ ιικά σωματίδια (vp) του ChAd-SARS-CoV-2-S⁷³ σε 50 μl PBS μέσω ενδομυϊκής ένεσης στο πίσω πόδι. Οι αποστραγγιζόμενοι βουβωνικοί λεμφαδένες συλλέχθηκαν 10 ημέρες αργότερα και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε ένα εναιώρημα μονοκυττάρου. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με βιοτινυλιωμένη ανασυνδυασμένη ακίδα SARS-CoV-2 (S2P) για 30 λεπτά στους 4 °C και στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα FACS και στη συνέχεια χρώση με αντι-CD19 BV421 (BioLegend # 115537), αντι-CD4 FITC (BioLegend #100405 ), αντι-IgD-PE-Cy7 (BioLegend # 405719), Streptavidin APC (BioLegend # 405207), χρωστική βιωσιμότητας υδάτινων κυττάρων (Invitrogen L34957) και αποκλεισμός CD16/CD32 Fc αντι-ποντικού (BioLegend # 156607). Τα ενεργοποιημένα Β-κύτταρα θετικά στην ακίδα (ζωντανά μονήρη CD4- CD19+ IgDlo Στρεπταβιδίνη+) ταξινομήθηκαν μαζικά σε διαλογέα BD FACSAriaII.

Παρασκευή και προσδιορισμός αλληλουχίας βιβλιοθήκης RNA-seq μονοκυττάρου

Τα ακόλουθα κιτ 10x Genomics χρησιμοποιήθηκαν για την προετοιμασία βιβλιοθηκών: Chromium Single Cell 5′ Library and Gel Bead Kit v2 (PN-1000006), Chromium Single Cell A Chip Kit (PN-1000152), Chromium Single Cell V(D)J Enrichment Kit , Mouse B cell (96rxns) (PN-1000072) και Single Index Kit T (PN-1000213). Η δημιουργία και ο γραμμωτός κώδικας GEM ακολουθήθηκαν από προετοιμασία cDNA και στη συνέχεια αντίδραση GEM RT και στάδια καθαρισμού σφαιριδίων. Το καθαρισμένο cDNA ενισχύθηκε για 10-14 κύκλους και στη συνέχεια καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας σφαιρίδια SPRIselect. Η συγκέντρωση cDNA προσδιορίστηκε με τρέξιμο δειγμάτων σε Bioanalyzer. Έγιναν εμπλουτισμοί στόχου BCR στο πλήρους μήκους cDNA ακολουθούμενη από προετοιμασία βιβλιοθηκών BCR όπως συνιστάται από τον οδηγό χρήστη 10x Genomics Chromium Single Cell V(D)J Reagent Kits (v1 Chemistry). Οι βιβλιοθήκες cDNA αλληλουχήθηκαν σε Novaseq S4 (Illumina), στοχεύοντας ένα διάμεσο βάθος αλληλουχίας 5000 ζευγών ανάγνωσης ανά κύτταρο.

Επεξεργασία αλληλουχιών BCR μονού κυττάρου

Οι αναγνώσεις FASTQ αποπολυπλέξης ζεύγους από 10x προφίλ V(D)J ενός κυττάρου Genomics υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία χρησιμοποιώντας την εντολή "cellranger vdj" από Cell Ranger v3.1.0 για ευθυγράμμιση με την αναφορά ποντικιού GRCm38 v3.1.0 (refdata-cellranger-vdj-GRCm38-alts-ensembl-3.1.0), δημιουργώντας 3760 συναρμολογημένες ακολουθίες BCR υψηλής εμπιστοσύνης για 4420 κύτταρα. Οι αλληλουχίες για διαλογή επιλέχθηκαν τυχαία από τις κορυφαίες κλωνικές ομάδες με >10 μέλη στην κλωνική ομάδα. Στη συνέχεια, η έξοδος Cellranger vdj αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το Change-O v0.4.6 εντός της σουίτας immcantation. Ο πρόσθετος ποιοτικός έλεγχος περιλάμβανε την εξέταση αλληλουχιών που έπρεπε να αναδιαταχθούν παραγωγικά και να έχουν έγκυρους σχολιασμούς γονιδίων V και J. Επιπλέον, διατηρήθηκαν μόνο κύτταρα με ακριβώς μία αλληλουχία βαριάς αλυσίδας σε συνδυασμό με τουλάχιστον μία αλληλουχία ελαφριάς αλυσίδας.

Περίληψη αναφοράς

Περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τον σχεδιασμό της έρευνας διατίθενται στο Σύνοψη αναφοράς χαρτοφυλακίου Nature που συνδέονται με αυτό το άρθρο.

• SEO Powered Content & PR Distribution. Ενισχύστε σήμερα.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. Ενδυναμώστε τον εαυτό σας. Πρόσβαση εδώ.
• PlatoAiStream. Web3 Intelligence. Ενισχύθηκε η γνώση. Πρόσβαση εδώ.
• PlatoESG. Αυτοκίνητο / EVs, Ανθρακας, Cleantech, Ενέργεια, Περιβάλλον, Ηλιακός, Διαχείριση των αποβλήτων. Πρόσβαση εδώ.
• BlockOffsets. Εκσυγχρονισμός της περιβαλλοντικής αντιστάθμισης ιδιοκτησίας. Πρόσβαση εδώ.
• πηγή: https://www.nature.com/articles/s41467-023-38965-w