Κυτταρικής καλλιέργειας

Τα καφέ λιποκύτταρα διαφοροποιήθηκαν από μια απαθανατισμένη κυτταρική σειρά καφέ προλιποκυττάρων ποντικού που παρέχεται ευγενικά από τον B. Spiegelman (Πανεπιστήμιο Χάρβαρντ) όπως περιγράφηκε προηγουμένως¹⁹. Τα προλιποκύτταρα διατηρήθηκαν και επεκτάθηκαν σε χαμηλή συρροή (<50%) σε ένα μέσο ανάπτυξης (Dulbecco's τροποποιημένο μέσο Eagle, υψηλή γλυκόζη (Gibco), συμπληρωμένο με 20% εμβρυϊκό βόειο ορό (Sigma-Aldrich), 20 mM HEPES (Sigma-Aldrich) και 100 U ml^-1 πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Gibco)). Για διαφοροποίηση, τα προλιποκύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) (Gibco, ρΗ 7.4, 1×), διαχωρίστηκαν με TrypLE Express και σπάρθηκαν σε πυκνότητα περίπου 23,000 κυττάρων cm^-2 στο μέσο ανάπτυξης. Το μέσο άλλαξε μετά από 24 ώρες σε μέσο διαφοροποίησης (Dulbecco's τροποποιημένο μέσο Eagle, υψηλή γλυκόζη, συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 20 nM ινσουλίνη, 1 nM τριιωδοθυρονίνη και 100 U ml^-1 πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη) και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 2 ημέρες. Στη συνέχεια, η διαφοροποίηση των κυττάρων προκλήθηκε με την προσθήκη ενός μέσου επαγωγής (μέσα διαφοροποίησης συμπληρωμένα με 0.125 mM ινδομεθακίνη, 0.5 μΜ δεξαμεθαζόνη και 0.5 mM ισοβουτυλομεθυλξανθίνη) για 2 ημέρες, μετά από τις οποίες το μέσο άλλαξε στο μέσο διαφοροποίησης για δύο επιπλέον ημέρες. Τα διαφοροποιημένα λιποκύτταρα πλύθηκαν μία φορά με μέσο λιμοκτονίας (μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle's, χαμηλής γλυκόζης (Gibco), συμπληρωμένο με γλυκόζη σε τελική συγκέντρωση 8 mM, 0.5% αλβουμίνη ορού βοοειδών (Sigma-Aldrich) και 100 U ml^-1 πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη) και επωάστηκε για 2 ώρες στο μέσο ασιτίας πριν από τη θεραπεία με ινσουλίνη NanoRods ή NanoRods αραιωμένη στο μέσο ασιτίας για τους χρόνους που αναφέρονται στο κύριο κείμενο. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά σε PBS και συλλέχθηκαν για την απομόνωση πρωτεΐνης για ανοσοκηλίδες ή RNA για έκφραση γονιδίου. Για ανάλυση IR με DNA-PAINT, τα προλιποκύτταρα διαφοροποιήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω με τις ακόλουθες τροποποιήσεις. Μετά την επεξεργασία με το μέσο επαγωγής, τα κύτταρα διαχωρίστηκαν με TrypLE Express και σπάρθηκαν στο μέσο διαφοροποίησης σε φρεάτια μ-Slide 18 Well Glass Bottom (ibidi). Μετά από 2 ημέρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με το μέσο ασιτίας για 2 ώρες και ακολούθησε επεξεργασία με 10 ηΜ ινσουλίνης στο μέσο ασιτίας για 10 λεπτά. Σε πειράματα ελέγχου, η προσθήκη ινσουλίνης παραλείφθηκε. Πριν από τη θεραπεία, τα διαφοροποιημένα λιποκύτταρα αναλύθηκαν οπτικά για να εκτιμηθεί η πυκνότητα της κυτταρικής επιφάνειας και να αξιολογηθεί η διαφοροποίηση των κυττάρων, και στη συνέχεια κατανεμήθηκαν τυχαία στις ομάδες θεραπείας και ελέγχου.

Τα κύτταρα διατηρήθηκαν, επεκτάθηκαν και διαφοροποιήθηκαν σε υγρή ατμόσφαιρα που περιείχε 5% CO₂ στους 37 °C.

DNA-PAINT του IR

Τα διαφοροποιημένα λιποκύτταρα σταθεροποιήθηκαν για 12 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT) με προθερμασμένη 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS, πλύθηκαν τρεις φορές με PBS, μπλοκαρίστηκαν για 90 λεπτά σε RT με ένα διάλυμα αποκλεισμού (3.0% βόειος ορός εμβρύου/0.1% Triton X -100 σε PBS) και επωάστηκαν με αντίσωμα β αντι-IR κουνελιού (Cell Signaling (4B8), αραίωση 1:300 στο διάλυμα αποκλεισμού) για 2 ημέρες στους 4 °C. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και επωάστηκαν με το νανοσωμάτιο FluoTag-XM-QC αντι-κουνελιού IgG (Massive Photonics) αραιωμένο 1:200 σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (Massive Photonics) για 1 ώρα σε RT. Μετά από τρεις πλύσεις με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με νανοσωματίδια χρυσού 80 nm (Sigma-Aldrich, αραίωση 1:5 στο ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού) για 10 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS και επωάστηκαν με 5 ηΜ σημασμένους με Cy3b κλώνους (Massive Photonics) αραιωμένοι σε ρυθμιστικό διάλυμα εικόνας (Massive Photonics).

Η απεικόνιση πραγματοποιήθηκε σε μικροσκόπιο Nikon ECLIPSE Ti-E με σύστημα Perfect Focus (Nikon Instruments), εφαρμόζοντας μια αντικειμενικού τύπου διαμόρφωση φθορισμού συνολικής εσωτερικής ανάκλασης χρησιμοποιώντας μια κυκλική μονάδα φθορισμού συνολικής εσωτερικής ανάκλασης iLAS2 (Gataca Systems) με εμβάπτιση λαδιού Αντικειμενικός φακός 1.49 αριθμητικού διαφράγματος CFI Plan Apo συνολικής εσωτερικής ανάκλασης φθορισμού ×100 (Nikon Instruments) εξοπλισμένος με βοηθητική μεγέθυνση Optovar ×1.5 που αντιστοιχεί σε τελικό μέγεθος pixel 87 nm. Το λέιζερ που χρησιμοποιήθηκε ήταν ένα OBIS 561 nm LS 150 mW (Συνεκτικό) με προσαρμοσμένη οπτική επέκταση δέσμης εισόδου iLas (Cairn) βελτιστοποιημένη για απεικόνιση μειωμένου πεδίου υπερ-ανάλυσης. Η δέσμη φωτός φθορισμού πέρασε πρώτα από έναν κύβο φίλτρου (89901, Chroma Technology) που περιείχε ένα τετραζωνικό φίλτρο διέγερσης, ένα διχρωικό φίλτρο τετραζώνης και ένα φίλτρο εκπομπής τετραζώνης (ZET405/488/561/640x, ZET405/488/561/640bs και /405/488/561m, Chroma Technology). Στη συνέχεια, το φως φθορισμού φιλτραρίστηκε φασματικά με ένα φίλτρο εκπομπής (ET640/595m, Chroma Technology) και απεικονίστηκε σε μια κάμερα συσκευής συζευγμένης φορτίου πολλαπλασιασμού ηλεκτρονίων iXon Ultra 50 (Andor). Το λογισμικό Micro-Manager v. 888 χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση 1.4 καρέ με πλαίσιο ανάγνωσης 12,000 MHz, έκθεση 10 ms και χωρίς κέρδος πολλαπλασιασμού ηλεκτρονίων. Συνολικά δέκα κύτταρα από τρία ανεξάρτητα πειράματα απεικονίστηκαν σε κάθε συνθήκη (Συμπληρωματικό Σημείωμα και Συμπληρωματικό Σχ. 1).

Παραγωγή και καθαρισμός INS-DNA

Ινσουλίνη (Merck, 1 mg ml^-1) αντέδρασε με διβενζοκυκλοοκτινο-σουλφο-N-υδροξυηλεκτριμιδυλεστέρας (DBCO-sulfo-NHS, Click Chemistry Tools; 690 μΜ) σε 100 mM Na₂CO₃ ρυθμιστικό (ρΗ 11.5) για 20 λεπτά σε ΘΔ. Η αντίδραση στη συνέχεια σβήστηκε για 5 λεπτά μέσω της προσθήκης βάσης Tris (Sigma-Aldrich, 100 mM). Το διάλυμα πλύθηκε τρεις φορές με 400 μΐ 100 mM Na₂CO₃ χρησιμοποιώντας μονάδες φυγόκεντρου φίλτρου Amicon Ultra 0.5 ml με μεμβράνη αποκοπής 3 kDa (Merck). Σε κάθε στάδιο πλύσης, οι στήλες περιστράφηκαν για 10 λεπτά στα 14,000xg. Μετά το τελικό στάδιο πλύσης, η ινσουλίνη-DBCO (690 μΜ) αναμίχθηκε με τροποποιημένο με αζίδιο DNA (Biomers, 35 μΜ, Συμπληρωματικός Πίνακας 3) σε 100 mM Na₂CO₃ και αφέθηκε να αντιδράσει για 3 ώρες σε RT. Η αντίδραση σβήστηκε με προσθήκη NaN₃ (Sigma-Aldrich, 6.9 mM). Τα δείγματα εκτελέστηκαν σε φυσικό πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (6% πολυακρυλαμίδιο 19:1 σε 1× TAE, 20 λεπτά, 200 V, ρυθμιστικό διάλυμα λειτουργίας TAE) και χρωματίστηκαν με SYBR Gold (Thermo Fisher) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, για επιβεβαίωση INS- Σχηματισμός DNA. Η απεικόνιση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση συσκευής απεικόνισης γέλης ImageQuant LAS 4000. Το πρωτόκολλο σύζευξης ινσουλίνης-DBCO-σουλφο-NHS βελτιστοποιήθηκε για να προωθήσει τη δέσμευση του ολίγονου ssDNA στη λυσίνη-29 της αλυσίδας Β (λυσίνη Β29) σε σύγκριση με τις ομάδες αμίνης στο N άκρο των αλυσίδων ινσουλίνης Α και Β. Η τιμή pKa της Β29 αμίνης είναι υψηλότερη από αυτή των αμινών των δύο N τερματικά (11.2 έναντι 8.6 και 6.8). Σε υψηλό pH, η ομάδα NHS του παράγοντα διασύνδεσης προβλέπεται ότι θα αντιδράσει κατά προτίμηση με την πιο βασική ομάδα αμίνης, η οποία είναι η Β29 λυσινο αμίνη³². Ως εκ τούτου, οι συνθήκες αντίδρασης του pH βελτιστοποιήθηκαν για την προώθηση ενός μόνο προϊόντος INS-DNA.

Τα μίγματα αντίδρασης INS-DNA καθαρίστηκαν με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης C₁₈ στήλη (Agilent Poroshell 120 EC-C₁₈) σε μια Amersham Pharmacia Biotech ÄKTA Ettan LC. Ρυθμιστικό διάλυμα Α (50 mM οξική τριαιθυλαμίνη) και ρυθμιστικό διάλυμα Β (90% ακετονιτρίλιο και 10% ρυθμιστικό διάλυμα Α) χρησιμοποιήθηκαν σε ένα προφίλ βαθμίδωσης, στο οποίο το ποσοστό του ρυθμιστικού διαλύματος Β αυξήθηκε από 30% σε 50% σε 20 λεπτά. Τα κλάσματα συλλέχθηκαν και περιστράφηκαν σε έναν συμπυκνωτή κενού (Thermo Scientific SpeedVac Savant DNA 120) για 30 λεπτά σε υψηλή θερμοκρασία για να απομακρυνθούν τα πτητικά συστατικά των ρυθμιστικών διαλυμάτων υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης. Οι επιλεγμένες κορυφές ανταλλάχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα σε PBS χρησιμοποιώντας μονάδες φυγόκεντρου φίλτρου Amicon Ultra 0.5 ml με μεμβράνη αποκοπής 3 kDa (Merck), περιστρέφοντας τρεις φορές για 10 λεπτά στις 14,000×g και πλύσιμο κάθε φορά με 400 μl PBS. Δείγματα καθαρισμένων κλασμάτων εκτελέστηκαν σε φυσικό πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και χρωματίστηκαν με SYBR Gold (Thermo Fisher) για να οπτικοποιηθεί το καθαρισμένο INS-DNA. Η τελική καθαρότητα των συζυγών αναλύθηκε για κάθε παρασκεύασμα μέσω τριών μεθόδων: σύγκριση των εντάσεων της ζώνης χρώσης αργύρου (Pierce Silver Stain Kit) σε ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (Invitrogen, 4–12% Bolt gel) έναντι των προτύπων ινσουλίνης (Merck) , σύγκριση της έντασης της ζώνης SYBR Gold σε ηλεκτροφόρηση φυσικής γέλης πολυακρυλαμιδίου έναντι προτύπων DNA (Integrated DNA Technologies) και μέσω του κιτ προσδιορισμού Qubit ssDNA (Qubit 4 Fluorimeter, Invitrogen). Οι τελικές συγκεντρώσεις του INS-DNA υπολογίστηκαν με βάση τις μετρήσεις Qubit ssDNA. Το καθαρισμένο INS-DNA καταψύχθηκε και αποθηκεύτηκε στους -20 °C μέχρι περαιτέρω χρήση.

Παραγωγή NanoRods και ινσουλίνης NanoRods

Οι δομές Origami παρασκευάστηκαν με ανάμειξη πλασμιδικού DNA ικριώματος (p7560, Tilibit, 10 nM) με τους κατάλληλους κλώνους (Integrated DNA Technologies, 100 nM) (Συμπληρωματικοί πίνακες 4-9) σε αναδιπλούμενο ρυθμιστικό διάλυμα (5.0 mM Tris σε ρΗ 8.5 (Sigma-Aldrich), 1.0 mM EDTA (Panreac AppliChem) και 12.5 mM MgCl₂ (Sigma-Aldrich)). Το μίγμα στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε θερμοκυκλοποιητή (MJ Research PTC-225 Gradient Thermal Cycler) και ανόπτεται με θέρμανση στους 80.0 °C για 5 λεπτά, ψύξη στους 60.0 °C στους 1.0 °C ανά λεπτό για 20 λεπτά και στη συνέχεια ψύξη αργά στους 20.0 °C °C στους 0.5 °C ανά λεπτό. Η περίσσεια συνδετήρων αφαιρέθηκε χρησιμοποιώντας μονάδες φυγόκεντρου φίλτρου Amicon Ultra 0.5 ml με μεμβράνη αποκοπής 100 kDa (Merck) περιστρέφοντας πέντε φορές για 2 λεπτά στα 14,000×g και πλύσιμο κάθε φορά με 400 μl του αναδιπλούμενου ρυθμιστικού διαλύματος. Η συγκέντρωση της καθαρισμένης δομής προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης DNA στα 260 nm (Thermo Scientific NanoDrop 2000). Κατόπιν προστέθηκε καθαρισμένο INS-DNA σε 3× στοιχειομετρική περίσσεια σε διαθέσιμες θέσεις δέσμευσης εκτεταμένων κλώνων στη δομή NanoRod και ανόπτηκε σε θερμοκυκλωτή με θέρμανση στους 37.0 °C για 1 ώρα, ψύξη στους 22.0 °C στους 0.1 °C ανά λεπτό, επώαση στους 22.0 °C για 14 ώρες και ψύξη στους 4.0 °C στους 0.1 °C ανά λεπτό. Το μη δεσμευμένο INS-DNA αφαιρέθηκε χρησιμοποιώντας μονάδες φυγόκεντρου φίλτρου Amicon Ultra 0.5 ml με μεμβράνη αποκοπής 100 kDa (Merck), περιστρέφοντας πέντε φορές για 2 λεπτά στα 14,000×g και πλύσιμο κάθε φορά με 400 μl PBS + 10 mM MgCl₂. Τα NanoRods ινσουλίνης αποθηκεύτηκαν στους 4 °C μέχρι περαιτέρω χρήση.

Ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης

Οι δομές NanoRod αναλύθηκαν με τρέξιμο δειγμάτων σε πηκτώματα αγαρόζης σε πάγο για 4 ώρες στα 70 V. Τα πηκτώματα αποτελούνταν από 2% αγαρόζη (Thermo Scientific TopVision Agarose) σε ρυθμιστικό διάλυμα TBE 0.5 x (Panreac AppliChem) συν 10 mM MgCl₂ (Sigma-Aldrich) και 1× SYBR Safe DNA χρώση (Invitrogen). Η απεικόνιση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση συσκευής απεικόνισης γέλης ImageQuant LAS 4000.

Δυναμική σκέδαση φωτός

Τα δείγματα NanoRod και ινσουλίνης NanoRod παρασκευάστηκαν σε PBS + 10 mM MgCl₂, η σύριγγα διηθήθηκε χρησιμοποιώντας μεμβράνες 0.1 μm (Merck) και αναλύθηκε σε ένα όργανο Zetasizer Ultra (Malvern Panalytical). Ελήφθησαν τρεις μετρήσεις στους 25 °C σε κυψέλη χαμηλού όγκου (ZSU1002) και στη συνέχεια υπολογίστηκε ο μέσος όρος.

Προσομοίωση oxDNA του NanoRod

Οι δομές NR, NR-1, NR-2, NR-4, NR-7 και NR-15 αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μοντελοποίηση χονδρόκοκκου oxDNA (https://oxdna.org/). Οι δομές NanoRod με κλώνους dsDNA που εκτείνονται από τις θέσεις ενσωμάτωσης ινσουλίνης δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας vHelix και μετατράπηκαν στη μορφή oxDNA χρησιμοποιώντας την τοποθεσία web tacoxDNA (http://tacoxdna.sissa.it/). Οι δομές υποβλήθηκαν στο oxDNA.org web server για προσομοίωση στους 37 °C, με 1 ως συγκέντρωση αλατιού, 1 × 10⁸ χρονικά βήματα με τη διαφήμισηt τιμή 0.0001 και ένα προκαταρκτικό βήμα χαλάρωσης με τις προεπιλεγμένες παραμέτρους. Οι προσομοιώσεις οπτικοποιήθηκαν και έγιναν βίντεο χρησιμοποιώντας το εργαλείο oxView (https://oxdna.org/).

TEM αρνητικής χρώσης

Καθαρισμένα NanoRods (10 nM) διανεμήθηκαν σε ένα χάλκινο πλέγμα TEM που υποστηρίζεται από άνθρακα (TEM-CF200CU50, Thermo Fisher Scientific) και επωάστηκαν για 60 δευτερόλεπτα πριν αφαιρεθεί το διάλυμα. Τα πλέγματα στη συνέχεια χρωματίστηκαν για 10 δευτερόλεπτα με 5 μΙ μυρμηκικού ουρανυλίου 2% β/ο, το οποίο στη συνέχεια απομακρύνθηκε. Η διαδικασία χρώσης επαναλήφθηκε επτά φορές και τα πλέγματα ΤΕΜ ξηράνθηκαν στον αέρα για 30 λεπτά πριν από την απεικόνιση. Πραγματοποιήθηκε απεικόνιση σε Talos 120C G2 (120 kV, ανιχνευτής Ceta-D) στα ×92,000 για όψεις κοντινού πεδίου. Οι ακατέργαστες εικόνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ (v1.53).

AFM

Οι δομές NanoRod απεικονίστηκαν σε έναν δίσκο από μαρμαρυγία στερεωμένο με εποξειδική κόλλα στο κέντρο μιας πλάκας μικροσκοπίου και περικλείεται από έναν πλαστικό δακτύλιο συνδεδεμένο στη διαφάνεια χρησιμοποιώντας Reprorubber. Οι νανοδομές αραιώθηκαν σε 1 nM σε ρυθμιστικό διάλυμα TE-Mg (5 mM βάση Tris, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl₂, ρΗ 8.0) και 10 μΙ μεταφέρθηκαν με σιφώνιο σε φρεσκοκομμένη μαρμαρυγία. Μετά από 30 δευτερόλεπτα, 4 μl 5 mM NiSO₄ προστέθηκε και επωάστηκε για άλλα 4.5 λεπτά. Η επιφάνεια στη συνέχεια ξεπλύθηκε με 1.0 ml ρυθμιστικού διαλύματος TE-Mg φιλτραρισμένου 0.1 μm και στη συνέχεια προστέθηκε 1.5 ml διηθημένου ρυθμιστικού διαλύματος ΤΕ-Mg στον δίσκο μαρμαρυγίας για απεικόνιση. Η απεικόνιση πραγματοποιήθηκε σε υγρό χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο ατομικής δύναμης JPK Instruments NanoWizard 3 Ultra με πρόβολο Bruker AC40 σε λειτουργία εναλλασσόμενου ρεύματος.

DNA-PAINT νανοδομών ινσουλίνης NanoRod

Τα πηγαδάκια μ-Slide 18 Well Glass Bottom (ibidi) καθαρίστηκαν με ισοπροπανόλη και ξηράνθηκαν με Ν₂. Τα φρεάτια επωάστηκαν με 1 mg ml^-1 Βιοτίνη βόειου ορού λευκωματίνη (Thermo Fisher) σε ρυθμιστικό διάλυμα Α (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl και 0.05% (v/v) Tween 20 σε pH 8.0) για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκε τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα Α και επωάστηκε με 0.5 mg ml^-1 νετραβιδίνη (Thermo Fisher) σε ρυθμιστικό διάλυμα Α για 5 λεπτά σε RT. Στη συνέχεια τα φρεάτια πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα Α που ακολουθήθηκαν από τρεις πλύσεις με ρυθμιστικό διάλυμα Β (5 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA και 0.05% (ν/ν) Tween 20 σε ρΗ 8.0). Στη συνέχεια, NanoRods 500 pM που ενσωματώνουν τέσσερις σημασμένους με βιοτίνη κλώνους DNA (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 2a), με INS-DNA που περιέχει μια ακολουθία σύνδεσης PAINT 9 νουκλεοτιδίων (DS1, Συμπληρωματικός Πίνακας 3), προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο για 5 λεπτά. Τα φρεάτια πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα Β. Στη συνέχεια, 1 ηΜ κλώνου απεικόνισης Atto-647N (IS1, Συμπληρωματικός Πίνακας 10) σε ρυθμιστικό διάλυμα Β συμπληρωμένο με σαρωτές οξυγόνου (πρωτοκατεχουϊκό οξύ (Sigma), πρωτοκατεχούχο 3,4-διοοξυγενάση (Sigma) και Trolox (Sigma)) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Για PAINT διπλής ανταλλαγής, τρεις ακολουθίες σύνδεσης (DS2, συμπληρωματικός πίνακας 10) προστέθηκαν και στα δύο άκρα των NanoRods. Τα δείγματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με τα φρεάτια να πλένονται δέκα φορές με ρυθμιστικό διάλυμα Β μεταξύ κάθε λήψης απεικόνισης. Κάθε λήψη απεικόνισης έγινε με διαφορετικό σκέλος απεικόνισης Atto-647N (IS1 και IS2, Συμπληρωματικός Πίνακας 10). Το λογισμικό Micro-Manager χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση 9,000 καρέ με πλαίσιο ανάγνωσης 10 MHz, έκθεση 200 ms και χωρίς κέρδος πολλαπλασιασμού ηλεκτρονίων (Συμπληρωματικό Σημείωμα και Συμπληρωματικά Σχήματα. 2 και 3).

SPR

Ένα όργανο Biacore T200 (Cytiva) χρησιμοποιήθηκε για τη διεξαγωγή των πειραμάτων SPR και τα δεδομένα αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ελέγχου συστήματος Biacore T200 v. 2.01. Το βιοτινυλιωμένο ECD-IR (Nordic BioSite) ακινητοποιήθηκε σε ένα Chip Sensor στρεπταβιδίνης SA (Cytiva). Ως ρυθμιστικό διάλυμα λειτουργίας χρησιμοποιήθηκε ρυθμιστικό διάλυμα HBS-P+ (Cytiva). Μετά την ακινητοποίηση του ECD-IR, εισήχθη χρόνος σταθεροποίησης 15 λεπτών για να επιτευχθεί μια σταθερή γραμμή βάσης. Τα NR-1, NR-2, NR-4, NR-7, NR-15, NR-8 και NR-8dsDNA εγχύθηκαν σε συγκέντρωση ινσουλίνης 11.4 ηΜ στο τρέχον ρυθμιστικό διάλυμα. Η ινσουλίνη και το INS-DNA εγχύθηκαν στα 55 nM, η ελάχιστη συγκέντρωση για να ληφθεί μια καμπύλη δέσμευσης που θα μπορούσε να αναλυθεί. Το NR εγχύθηκε ως αρνητικός έλεγχος σε συγκέντρωση ίση με την υψηλότερη συγκέντρωση NanoRod που χρησιμοποιήθηκε στις ενέσεις ινσουλίνης NanoRod (NR-1 = 11.4 nM). Εναλλακτικά, τα NR-2, NR-4, NR-7 και NR-15 εγχύθηκαν σε συγκέντρωση νανοδομής 5.7 nM (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχ. 4e), και NR-7^K-PEG εγχύθηκε επίσης συγκέντρωση ινσουλίνης 50 nM (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 9c). Η έγχυση κάθε δείγματος πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια φάση συσχέτισης 180 δευτερολέπτων και μια φάση διάστασης 300 δευτερολέπτων. Η σταθερά ισορροπίας διάστασης (K_D), σταθερά ρυθμού συσχέτισης (k_on) και σταθερά ρυθμού διάστασης (k_off) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό BIAevaluation 3.0. ο t_1/2 Οι τιμές, που καθορίζουν τον χρόνο παραμονής, προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο ln2/k_off. Για να συγκριθεί η σύνδεση των δομών NR-7 μεταξύ IR και IGF1R, πρωτεΐνες ECD-IR και ECD-IGF1R (Nordic BioSite) ακινητοποιήθηκαν σε δύο διαφορετικά κύτταρα ροής ενός τσιπ αισθητήρα CM5 μέσω αντιδράσεων σύζευξης αμίνης, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η δέσμευση της ινσουλίνης και του INS-DNA δοκιμάστηκε με έγχυση διαφορετικών συγκεντρώσεων ινσουλίνης (6.2, 18.5, 55.6, 166.7 και 500.0 nM) στο τρέχον ρυθμιστικό διάλυμα (HBS-P+) στον κινητικό τρόπο ενός κύκλου, χρησιμοποιώντας μια φάση συσχέτισης 140 s και φάση διάστασης 300 s. Η δέσμευση του NR-7 δοκιμάστηκε με έγχυση μιας μοναδικής συγκέντρωσης δομής (11.4 nM ινσουλίνης) χρησιμοποιώντας μια φάση σύνδεσης 180 s και μια φάση διάστασης 300 s.

Τζελ Coomassie

Εδώ 0.5 μg ανασυνδυασμένου ECD-IR (Nordic BioSite) επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό δείγματος Laemmli (Bio-Rad). Για συνθήκες αναγωγής, προστέθηκε 2-μερκαπτοαιθανόλη σε τελική συγκέντρωση 2.5%. Τα δείγματα μετουσιώθηκαν στους 80 °C για 10 λεπτά, αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου και χρωματίστηκαν με ασφαλή πρωτεϊνική χρώση GelCode Blue (Thermo Fisher Scientific).

Δοκιμασία μετατόπισης γέλης

Τα NanoRods (NR και NR-7) στα 20 nM επωάστηκαν με 300 nM ανασυνδυασμένη εξωκυτταρική περιοχή ανθρώπινου IR (Nordic BioSite) ή με PBS για 30 λεπτά στους 4 °C. Τα δείγματα στη συνέχεια έτρεξαν σε πήκτωμα αγαρόζης 2% και χρωματίστηκαν με SYBR Safe.

Immunoblotting

Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, λύθηκαν σε ρυθμιστικό προσδιορισμού ραδιοανοσοκαθίζησης (Sigma-Aldrich) συμπληρωμένο με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και φωσφατάσης (Thermo Fisher Scientific) και επωάστηκαν σε πάγο με ανακίνηση για 30 λεπτά. Το προϊόν λύσης καθαρίστηκε με φυγοκέντρηση (20,000 χg για 20 λεπτά στους 4 °C) και τα προϊόντα λύσης πρωτεϊνών ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης Bradford (Bio-Rad). Τα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης επαναιωρήθηκαν στο ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος Laemmli (Bio-Rad) που περιείχε 2.5% 2-μερκαπτοαιθανόλης, μετουσιώθηκε στους 80 °C για 10 λεπτά, διαχωρίστηκε με ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκε σε μεμβράνες πολυβινυλιδίου. Οι μεμβράνες επωάστηκαν 1 ώρα σε ένα διάλυμα αποκλεισμού (ρυθμιστικό διάλυμα Tris με 0.1% Tween 20 (TBST) και 5.0% ξηρό γάλα χωρίς λιπαρά), ακολουθούμενη από ολονύκτια επώαση στους 4 °C με πρωτογενή αντισώματα έναντι φωσφο-IR βήτα/IGF1R βήτα (CST 3024, 1:1,000), φωσφο-ΑΚΤ-S473 (CST 4058, 1:1,000) ή GAPDH (Invitrogen ΡΑ1-987, 1:5,000). Μετά από τρεις πλύσεις με TBST, οι μεμβράνες επωάστηκαν με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου (Invitrogen, 31460, 1:5,000) για 1 ώρα σε RT. Η ανίχνευση της υπεροξειδάσης χρένου διεξήχθη από υπόστρωμα χημειοφωταύγειας Immobilon Forte σε σύστημα απεικόνισης ChemiDoc (Bio-Rad). Η πυκνομετρία ζώνης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

Κυτταρομετρία ροής

Παρασκευάστηκαν διαφοροποιημένα λιποκύτταρα που στερούνται ορού όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα λιποκύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με ισορροπημένο διάλυμα άλατος του Hanks (HBSS) και διαχωρίστηκαν σε διάλυμα κολλαγενάσης D (1.5 U ml^-1 κολλαγενάση D (Roche) και 10 mM CaCl₂ σε HBSS) για 20 λεπτά στους 37 °C. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε HBSS, διηθήθηκαν μέσω ενός εξισορροπημένου με HBSS 35 μm κυτταρικού φίλτρου (BD Biosciences), σφαιροποιήθηκαν στα 300×g για 5 λεπτά και επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα χρώσης (1× PBS και 1% αλβουμίνη βόειου ορού). Τα νεκρά κύτταρα επισημάνθηκαν με LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και, στη συνέχεια, το κυτταρικό εναιώρημα σφαιροποιήθηκε στα 300×g για 5 λεπτά και επαναιωρήθηκε στο ρυθμιστικό διάλυμα χρώσης. Εδώ ~ 100,000 κύτταρα επωάστηκαν με δομές NanoRod σημασμένες με ATTO-10 647 ηΜ σε τελικό όγκο 100 μl για 10 λεπτά στους 37 °C. Τα κύτταρα που επωάστηκαν χωρίς τις δομές NanoRod χρησιμοποιήθηκαν ως ο μη επεξεργασμένος έλεγχος. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με το ρυθμιστικό διάλυμα χρώσης με φυγοκέντρηση στα 300 χg για 5 λεπτά. Οι μετρήσεις κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκαν σε BD FACSCANTO II με λογισμικό BD FACSDIVA v. 9.0 (BD Biosciences). Τα ζωντανά κύτταρα λιποκυττάρων αναγνωρίστηκαν αρχικά με πυλώνοντας κύτταρα στο FSC-A έναντι του AmCyan-A, ακολουθούμενο από πύλη στο FSC-A έναντι του FSC-H για την ανίχνευση μονών. Τα δεδομένα που αποκτήθηκαν αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo 10.7.1 (BD Biosciences). Ο γεωμετρικός μέσος όρος της έντασης φθορισμού μετά την κανονικοποίηση στον μη επεξεργασμένο μάρτυρα χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί ο βαθμός επισήμανσης κυττάρων από τα NanoRods.

Παρασκευή βιβλιοθήκης RNA-seq και προσδιορισμός αλληλουχίας

Το συνολικό RNA απομονώθηκε από διαφοροποιημένα λιποκύτταρα χρησιμοποιώντας Quick-RNA Microprep Plus Kit (Zymo Research) και 500 ng καθαρισμένου RNA χρησιμοποιήθηκαν για παρασκευή βιβλιοθήκης mRNA-seq χρησιμοποιώντας TruSeq RNA Library Prep Kit v2 σύμφωνα με το πρωτόκολλο χαμηλού δείγματος του κατασκευαστή. Η ποσοτικοποίηση της βιβλιοθήκης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα QuantiFluor dsDNA (Promega) σύμφωνα με το πρωτόκολλο πλακών πολλαπλών φρεατίων του κατασκευαστή σε συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών πολλαπλών λειτουργιών Varioskan LUX (Thermo Fisher). Το μέγεθος και η ποιότητα της βιβλιοθήκης αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας Bioanalyser 2100 και High Sensitivity DNA Kit (Agilent). Οι βιβλιοθήκες μετουσιώθηκαν και αραιώθηκαν χρησιμοποιώντας το τυπικό πρωτόκολλο κανονικοποίησης NextSeq (Illumina) και η αλληλουχία πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αναγνώσεις ενός άκρου (1 × 75 bp) με κιτ NextSeq 500/550 High Output v. 2.5 (75 κύκλοι) σε πλατφόρμα NextSeq 550 ( Illumina).

Ποσοτικοποίηση RNA-seq, ανάλυση DEG και GSEA

Οι αναγνώσεις αλληλουχίας χαρτογραφήθηκαν έναντι ενός μεταγραφώματος αναφοράς του μυς αλληλουχίες μεταγραφής που κωδικοποιούν πρωτεΐνη (απελευθέρωση M29, GRCm39; https://www.gencodegenes.org/mouse/) και ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Salmon 1.7.0 (αναφ. ³³). Οι πίνακες καταμέτρησης δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο tximport³⁴ και οι λίστες των DEG ελήφθησαν χρησιμοποιώντας το πακέτο DESeq2 (έκδ. 1.34.0)³⁵, όπου μόνο τα γονίδια με προσαρμοσμένα P τιμές ίσες ή κάτω από 0.001 και ένα ημερολόγιο₂Το όριο αλλαγής αναδίπλωσης στο ±0.58 εξετάστηκε για περαιτέρω ανάλυση. Οι χάρτες θερμότητας και τα διαγράμματα UpSet δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το ComplexHeatmap (έκδ. 2.10.0)³⁶. Το GSEA για βιολογικές διεργασίες τόσο με όρους γονιδιακής οντολογίας όσο και με μονοπάτια KEGG πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια ταξινομημένη λίστα γονιδίων ως είσοδο στο clusterProfiler (έκδ. 4.2.2)³⁷ και μια σημασία προσαρμοσμένη σε ψευδή ανακάλυψη-ποσοστό P τιμές κάτω από 0.10 και 0.05, αντίστοιχα.

Μικροενέσεις Zebrafish και ποσοτικοποίηση ελεύθερης γλυκόζης

Το NanoRod και η ινσουλίνη NanoRods αναμίχθηκαν με ολιγολυσίνη-PEG (Κ₁₀-ΠΑΣΣΑΛΟΣ_5K, Πολυμερή Alamanda) σε αναλογία 1:1 μεταξύ των αμινών των λυσινών σε Κ₁₀-ΠΑΣΣΑΛΟΣ_5K και τα φωσφορικά άλατα στο DNA³⁰και επωάστηκε σε RT για 30 λεπτά πριν από μια μικροέγχυση 2 nl του δείγματος σε κάθε προνύμφη ψαριού ζέβρα. Τα δείγματα για ένεση παρασκευάστηκαν σε τελική συγκέντρωση δομών 100 nM για τα επικαλυμμένα δείγματα NanoRod και σε τελική συγκέντρωση 100 nM ινσουλίνης για τα δείγματα NanoRod επικαλυμμένης ινσουλίνης (που αντιστοιχούν σε 100.0 και 14.3 nM NanoRods για NR-1^K-PEG και NR-7^K-PEG, αντίστοιχα). Ένεση 1 nl ανθρώπινης ινσουλίνης σε συγκέντρωση 100 nM σε προνύμφες ψαριών ζέβρα έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί μείωση στα επίπεδα ελεύθερης γλυκόζης και μεταγραφικές αλλαγές σύμφωνα με τη σηματοδότηση της ινσουλίνης³⁸. Ως εκ τούτου, εγχύαμε 2 nl συγκέντρωσης ινσουλίνης 100 nM στις αναλύσεις μας για να αξιολογήσουμε τις επιδράσεις που προκαλούνται από την ινσουλίνη στα επίπεδα ελεύθερης γλυκόζης. Δεδομένου ότι ο συνολικός όγκος αίματος για ένα ζέβρα 2 dpf είναι 60–89 nl (αναφ. ³⁹), η εκτιμώμενη συγκέντρωση της εγχυόμενης ινσουλίνης στις αναλύσεις μας θα ήταν περίπου 2–3 nM. Σε αυτές τις δοκιμασίες, ήμασταν επίσης περιορισμένοι στην ποσότητα του δείγματος που εγχύθηκε, με υψηλότερα επίπεδα έγχυσης (3 και 4 nl) που είχαν ως αποτέλεσμα την κακή επιβίωση των προνυμφών.

Η συντήρηση και η διασταύρωση του ζέβρα (D. rerio) οι γραμμές διεξήχθησαν σε συμμόρφωση με τη σουηδική νομοθεσία για τους κανονισμούς για την καλή διαβίωση των ζώων που εγκρίθηκαν από τη Στοκχόλμη djurförsöksetiska nämnd. Δεδομένου ότι για την αφαίρεση των β-κυττάρων και τα πειράματα ανάλυσης ελεύθερης γλυκόζης χρησιμοποιήθηκαν μόνο ζώα ηλικίας μικρότερης των 5 ημερών, δεν απαιτείται δεοντολογική άδεια σύμφωνα με το 2010/63/ΕΕ. Οι διαγονιδιακές γραμμές Zebrafish που χρησιμοποιήθηκαν έχουν περιγραφεί προηγουμένως, συγκεκριμένα, Tg(ins:ΚΑΠ-NTR)^s892 (αναφ. ²⁷) Και Tg(ins:Kaede)^s949 (αναφ. ²⁸).

Η αφαίρεση των β-κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε παιδιά δύο ημερών Tg(ins:ΚΑΠ-NTR) Και Tg(ins:ΚΑΠ-NTR);Tg(ins:Kaede) έμβρυα με επεξεργασία με 10 mM MTZ (Sigma-Aldrich) αραιωμένο σε 1% DMSO (VWR) σε διάλυμα αυγού νερού (E3) συμπληρωμένο με 0.2 mM 1-φαινυλ-2-θειουρία (PTU, Acros Organics) για 24 ώρες. Μετά από κατάλυση β-κυττάρων, ηλικίας τριών ημερών Tg(ins:ΚΑΠ-NTR) προνύμφες (72 hpf) αναισθητοποιήθηκαν σε 0.01% τρικαΐνη και εγχύθηκαν με 2 nl 1× PBS, μη τροποποιημένη ινσουλίνη ή επικαλυμμένα NanoRod/ινσουλίνη NanoRods στην κοινή καρδινάλια φλέβα (αγωγός Cuvier)⁴⁰. Ερυθρό φαινόλης (Sigma-Aldrich) σε τελική συγκέντρωση 0.1% προστέθηκε στα δείγματα PBS, ινσουλίνης ή επικαλυμμένης ινσουλίνης NanoRod για να βοηθήσει στην οπτικοποίηση της διαδικασίας μικροέγχυσης και στον προσδιορισμό των επιτυχώς εγχυόμενων προνυμφών. Οι προνύμφες του Zebrafish κατανεμήθηκαν τυχαία στις ομάδες θεραπείας. Τα επίπεδα ελεύθερης γλυκόζης μετρήθηκαν όπως περιγράφεται αλλού⁴¹ χρησιμοποιώντας ένα ενζυματικό κιτ βασισμένο σε φθορισμό (BioVision). Ομάδες τριών έως έξι ενέσιμων προνυμφών χρησιμοποιήθηκαν ανά συνθήκη/αντίγραφο.

Συνεστιακή απεικόνιση

Tg(ins:ΚΑΠ-NTR);Tg(ins:KaedeΟι προνύμφες που είχαν αφαιρεθεί συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά τη θεραπεία με αφαίρεση, αναισθητοποιήθηκαν και εγχύθηκαν σύμφωνα με το προηγουμένως αναφερθέν πρωτόκολλο και σταθεροποιήθηκαν σε διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 4% πριν αναλυθούν οι αριθμοί των β-κυττάρων με συνεστιακή απεικόνιση. Οι συνεστιακές εικόνες αποκτήθηκαν με ένα μικροσκόπιο Leica TCS SP8 και το λογισμικό LAS X (έκδ. 3.5.5.19976). Οι πρωτογενείς παγκρεατικές νησίδες των β-κυττάρων που έχουν αφαιρεθεί Tg(ins:ΚΑΠ-NTR);Tg(ins:Kaede) οι προνύμφες σαρώθηκαν με αντικειμενικό στόχο εμβάπτισης στο νερό ×40 και το z Οι στοίβες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Fiji (v1.53). Όλες οι εμφανιζόμενες εικόνες ελήφθησαν από το ίδιο πείραμα και οι τιμές αντίθεσης προσαρμόστηκαν για λόγους οπτικοποίησης. Η ποσοτικοποίηση των β-κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε αρχικές μη τροποποιημένες εικόνες.

Στατιστική ανάλυση

Δεν χρησιμοποιήθηκαν στατιστικές μέθοδοι για τον προκαθορισμό των μεγεθών του δείγματος, αλλά τα μεγέθη του δείγματος ήταν παρόμοια με αυτά που αναφέρθηκαν σε προηγούμενες δημοσιεύσεις^28,38,42. Δείγματα κυτταρικής καλλιέργειας και ζώα κατανεμήθηκαν τυχαία στις ομάδες ελέγχου και θεραπείας. Η συλλογή και η ανάλυση δεδομένων δεν πραγματοποιήθηκαν τυφλά στις συνθήκες των πειραμάτων. Τα μεμονωμένα σημεία δεδομένων σχεδιάζονται για τα περισσότερα γραφήματα. Το μέγεθος του δείγματος (n) του αριθμού των πειραματικών βιολογικών επαναλήψεων και των στατιστικών μεθόδων που χρησιμοποιήθηκαν υποδεικνύονται στις αντίστοιχες θρυλικές γραφικές παραστάσεις. Τα σύνολα δεδομένων δοκιμάστηκαν για κατανομή Gauss και ακολουθήθηκε από την κατάλληλη στατιστική δοκιμή. Η στατιστική ανάλυση και η γραφική αναπαράσταση των δεδομένων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το GraphPad Prism 9.4.0. Διεξήχθη δοκιμή Mann-Whitney με δύο ουρές για να συγκριθούν οι ιδιότητες συστάδας μεταξύ των κυττάρων ελέγχου και των κυττάρων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ινσουλίνη. Για ποσοτικοποιήσεις στυπώματος western, πραγματοποιήθηκε ανάλυση διακύμανσης μονής κατεύθυνσης (ANOVA) που ακολουθήθηκε από τη δοκιμή πολλαπλών συγκρίσεων Dunnett. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των β-κυττάρων, πραγματοποιήθηκε η δοκιμή Kruskal–Wallis που ακολουθήθηκε από τη δοκιμή πολλαπλών συγκρίσεων του Dunn. Η ανάλυση των τιμών της ελεύθερης γλυκόζης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA με τη δοκιμή πολλαπλών συγκρίσεων του Tukey.

Περίληψη αναφοράς

Περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τον σχεδιασμό της έρευνας διατίθενται στο Σύνοψη αναφοράς χαρτοφυλακίου Nature που συνδέονται με αυτό το άρθρο.

• SEO Powered Content & PR Distribution. Ενισχύστε σήμερα.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. Ενδυναμώστε τον εαυτό σας. Πρόσβαση εδώ.
• PlatoAiStream. Web3 Intelligence. Ενισχύθηκε η γνώση. Πρόσβαση εδώ.
• PlatoESG. Ανθρακας, Cleantech, Ενέργεια, Περιβάλλον, Ηλιακός, Διαχείριση των αποβλήτων. Πρόσβαση εδώ.
• PlatoHealth. Ευφυΐα βιοτεχνολογίας και κλινικών δοκιμών. Πρόσβαση εδώ.
• πηγή: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01507-y